Quantitative Analysis of MicroRNA in a Single Cell Using Atomic Force Microscopy

Abstract

단 분자 힘 분광학의 중요성과 필요성

분자 간에 서로 작용하는 힘은 자연계에서 일어나는 근본적인 현상들에 관여한다. 일례로 세포의 움직임이나 DNA의 복제 혹은 분리는 분자 수준의 힘에 의하여 일어난다. 따라서 힘은 생명 과학과 재료 과학에 있어 구조적, 기능적으로 새로운 중요 변수가 되므로, 여러 상호작용들을 보다 근본적으로 이해하기 위한 힘의 측정은 매우 중요하다. 하지만 기존의 방법으로는 결과값이 집합 평균 (ensemble average)으로 측정되어, 단일 분자 수준으로 다른 특성을 가진 복잡한 분자의 단계적 거동을 관찰하기 힘들다. 그리고 적용 모델에 따라 그 해석이 크게 차이가 나는 단점이 있다. 따라서 단일 분자 수준의 단계적인 거동을 관찰하기 위한 요구로, 단분자 수준으로 힘을 측정할 수 있는 분석 방법인 단분자 힘 분광학 (single molecule force spectroscopy, SMFS)이 대안으로 제시되었다. 단분자 힘 분광학은 picoNewton 수준의 극 미세 힘을 가함으로써 표적 분자의 구조를 변화시키거나 분자간 상호작용을 유도하여 물리적 성질을 관찰하는 방법으로, 광학 집게 (optical tweezers), 자석 집게 (magnetic tweezers), 원자 힘 현미경 (atomic force microscopy, AFM) 등이 있다. 특히 원자힘 현미경은 탐침과 시료에 두 물질을 도입하고, 탐침을 시료 가까이에 접근시킬 때, 두 물질 안에 존재하는 원자간의 인력과 척력에 의해 발생하는 상호작용힘을 측정할 수 있는 장비 이다. 단일 분자에서부터 세포에 이르기까지 생물학적인 분자간의 상호작용력의 크기를 수 pN의 감도로 알아낼 수 있으며, 나노 미터 수준의 고해상도 이미징이 가능하다. AFM을 이용한 많은 실험 팀의 선행연구 결과는 원자힘 현미경이 표면 위의 표적 유전자의 분포, 표적 유전자의 정량 분석 및 생물학적인 기능에 대한 메커니즘을 알아내는데 응용할 수 있음을 보여주었다.

MicroRNA (miRNA) 분석 기술의 동향

1993년 Ambro 연구팀에 의해 처음 발견된 miRNA는 19-25 nucleotide (nt)의 길이를 가지는 단일 가닥의 RNA 분자를 말한다. miRNA는 다른 여러 개의 단백질과 함께 RNA-induced silencing complex (RISC)를 형성한다. 이 복합체는 표적 mRNA의 번역되지 않은 3’-말단에 결합하고, 단백질의 발현을 억제하여 생물학적 기능을 제어한다. 많은 연구진들에 의하여 miRNA가 세포 증식 (cell proliferation), 세포 사멸 (cell death), 세포 분화 (cell differentiation) 그리고 인슐린 분비 (insulin secretion)등을 포함한 다양한 생물학적 기능과 밀접한 관련이 있다는 연구 결과가 보고되어 왔다. miRNA 분비 패턴은 질병이 발병한 특정 조직을 정상 조직과 비교 했을 때, 적게 분비 되거나 많이 분비되는 특징을 보이는데, 특히 miRNA 분비량에 따른 종양 억제 (tumor suppressor)와 관련되어 연구가 많이 진행되고 있다. 따라서 miRNA 분석은 생물학적 기능을 관찰하고자 하는 목적뿐만 아니라, 질병 조기 진단이나 치료의 목적으로도 중요하다. 일반적으로 miRNA 분석은 northern blotting, microarray 그리고 quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) 등으로 이루어진다. 하지만, northern blotting 은 분석 효율이 낮기 때문에 많은 양의 total RNA가 필요하며, 분석 시간이 오래 걸린다는 단점이 있다. 따라서 이 방법은 적은 양 (500 ea/cell)이 발현되는 miRNA의 분석에 적합하지 않다. 그리고 출처가 제한된 세포나 조직의 경우에는 분석에 한계를 보인다. Microarray는 한번에 수십만 개의 유전자 데이터를 분석할 수 있다는 장점이 있다. 분석의 정확성을 높이기 위해서는 detection probe에 타켓 물질이 선택적인 혼성화가 될 수 있어야 한다. 따라서 신호 왜곡을 막을 수 있도록 melting temperature의 표준화 작업 (normalization)이 필요하다. 그러나 서열의 길이가 짧고, 유사성이 높은 miRNA은 melting temperature의 normalization이 어렵다. qRT-PCR 방법은 적은 양의 miRNA를 상보적인 DNA로 역전사 시킨 뒤, 이 DNA를 증폭 시켜 얻은 산물의 정량을 분석하는 방법이다. 하지만 역전사 시켜 얻은 cDNA 단편의 끝에 대응하는 primer의 길이가 miRNA의 길이와 비슷하여, polymerase에 의한 증폭 효율이 왜곡될 가능성이 있다. 또한 짧은 시퀀스간에 cross linking이 일어날 수 있기 때문에 분석 데이터의 신뢰성이 낮을 수 있다. 따라서 질병 조기 진단이나 치료의 목적으로 단일 세포 내 존재하는 miRNA를 정확하게 분석하기 위해서는 증폭 과정 없이 높은 민감도와 정밀도를 가지는 새로운 분석 기술 개발이 필요하다.

단일 세포 내 miRNA 정량 분석

이 연구는 원자 힘 현미경을 이용하여 세포 내에 극미량 (~500개) 존재하는 miRNA를 선택적으로 정량할 수 있는 분석법 개발에 초점을 맞추었다. 먼저 AFM 실험에서 miRNA의 짧은 서열 길이로 인한 noise level과 특이적인 힘을 효율적으로 구별할 수 있도록 최적화된 시스템을 구축할 필요성이 있었다. 또한 단일 세포 내 miRNA의 분석을 가능하게 하는 민감도의 향상과 분석 선택성의 향상에 주안점을 두었다. 따라서 AFM 분석 시스템은 기존의 단일 DNA-단일 DNA 상호작용을 이용한 방법과는 다르게 RNA/DNA duplex와 이를 인지하는 단백질을 이용한 방법을 고려 하였다. Tip 끝에는 RNA/DNA duplex에만 선택적으로 결합하는 hybrid binding domain (HBD)을 탐침 끝에 도입하였다. 그리고 표면에는 상용화된 arrayer 장비로 miRNA를 포획할 수 있는 상보적인 시퀀스로 구성된 100 마이크로미터의 지름을 갖는 스팟을 제작하고, miRNA를 혼성화 하여 샘플을 준비하였다. Control 실험 결과 HBD tip이 miRNA를 분석 한계인 10 fM 수준까지 검출 할 수 있음을 확인하였다. HBD 분자는 RNA/DNA의 minor groove에 비서열 특이적 결합하는 특징을 보이는 것으로 알려져 있기 때문에, 세포 내에 존재하는 다양한 유전 물질 존재 하에 선택적으로 miRNA/DNA duplex를 검출할 수 있는지 알아볼 필요성이 있었다. 그 결과, RNA/DNA duplex와 선택적인 결합이 가능하며, ssDNA, dsDNA 그리고 dsRNA와는 결합하지 않는 것으로 선행연구에서 보고된 바와 동일하게 AFM mapping에서도 RNA/DNA가 표면에 존재하는 경우에서만, force event가 압도적으로 많은 것을 확인하였다. 또한, 세포 내에 동시에 존재하는 mature miRNA와 pre-miRNA는 서열의 일부 혹은 전체가 일치하기 때문에 mature miRNA에 대한 capture probe에 pre-miRNA가 붙을 수 있다. 따라서 microarray 혼성화 온도, 시간, 세척 시간 등의 조건을 변화 시켜 mature miRNA만을 혼성화 시킬 수 있는 최적화에는 한계가 있었으며, 효율적으로 mature form과 precursor form을 구별할 수 있는 선택성에 대한 추가 실험이 요구 되었다. AFM을 이용하여 경향성을 알아본 실험에서 pre-miR-134 샘플을 이용하였을 때에는 force map에서는 cluster를 관찰할 수 없었다. 따라서 HBD가 pre-miR-134를 구별하는 것으로 추측할 수 있었다. precursor가 인식되지 않는 이유는 무엇인지에 대해서 추가 실험을 통해서 알아보았는데, 상대적으로 긴 3' 말단이 존재할 때, 짧은 5' 말단이 존재할 때 보다 클러스터가 관찰되지 않았다. 이는 3' 말단의 결합하지 않는 서열이 결합한 서열위로 추가적으로 결합하여 triplex와 비슷한 입체적인 배향으로 인하여 miRNA/DNA duplex에 HBD의 결합을 방해하는 것으로 결론 내릴 수 있었다. 세포 안에 존재하는 miRNA의 평균 카피 수는 약 500 개로 알려져 있다. 따라서 miRNA 정량 분석의 민감도를 높이기 위하여 지름 3-8 μm를 가지는 소형 스팟을 제작하였다. 세포 내에 존재하는 표적 miRNA 정량 분석 가능성을 확인하기 위해서 240 개에서 2400 개에 해당되는 농도 (10 - 100 aM)에 해당되는 synthetic miR-134 시료를 대상으로 정량 분석한 결과, 농도와 검출 miRNA는 선형으로 비례하며, 평균 혼성화 효율은 78% 인 것을 확인하였다. 쥐의 신경 단일 신경세포 내에 존재하는 miR-134을 정량 분석하기 위하여 신경 세포는 쥐의 신경 세포를 Micropipette (single-cell) aspiration을 사용하여 분리하고, 이것으로부터 total RNA를 추출, 정제하여 분석하였다. 신경 세포 내 존재하는 miR-134는 KCl (40 mM, 2 h)의 자극에 의해 평균 변화량은 PCR 정량 분석을 이용한 결과와 문헌에서 보고된 값이 비슷한 경향을 보임을 확인하였다. 하지만 모든 세포에서 동일하게 증가하는 것이 아니라, 발현 변화량은 세포 간 차이가 존재하는 것을 확인하였다. 결론적으로 본 기술로 단일세포 내 존재하는 miRNA를 분석할 수 있을 뿐만 아니라, 배양 상태 등의 조건에 따른 마이크로 RNA 발현량 차이를 알아낼 수 있음을 입증하였다. 따라서, 본 연구 결과는 질병의 조기 진단 (diagnosis)이나, 병의 예후 (prognosis)를 목적으로 유용하게 사용될 가능성이 있으며, 치료 경과를 관찰하는 목적으로도 응용될 수 있을 것으로 기대한다.