단백질 다중 패널을 이용한 췌장암 진단 성능의 향상

Abstract

높은 사망률과 무증상 성질로 인해 췌장선암(Pancreatic Ductal Adenocarcinoma, PDAC)의 조기 발견율은 매우 낮다. 대부분의 췌장선암 환자는 초기 진단 후 1 년 이내에 사망하고, 5년 생존율은 약 7 % 수준이다. 환자의 대부분이(약 80%) 초기 단계에서 증상이 나타나지 않아 예후가 좋지 않으며, 사실상 유일한 치료법은 외과적 수술을 통한 절제이다. 본 연구는 기존의 췌장선암 바이오마커인 CA19-9의 성능을 보완하여, 수술 가능한 환자군(췌장선암 1/2기)을 조기 발견할 수 있는 바이오마커 패널을 발굴하는 것을 목표로 진행하였다.

이에, 우리는 국내 5개 대형 병원(국립 암센터, 서울대학교병원, 삼성서울병원, 아산병원, 연세 세브란스 병원) 및 1개의 건강검진 센터(서울대학교병원 강남 건강검진 센터)에서 모은 1,000여개의 플라즈마 샘플을 수집하여 췌장선암 조기 진단용 바이오마커의 발굴 / 확인 / 검증 과정을 거쳤다.

우선, 문헌 파악 및 데이터베이스 검토를 통한 생물정보학적 방법(질병 네트워크 구축/분석, 가중치 부여, 우선순위 설정 등)을 이용하여 약 500개의 바이오마커 후보를, 세포 마이크로어레이 실험을 통해 약 500여개의 바이오마커 후보를 선정하여, 1,000여개의 바이오마커 후보군을 수립하였다. 이후 이 후보군에 대해 다중 반응 모니터링 질량 분석법(Multiple Reaction Monitoring Mass Spectrometry)을 이용하여, 실제 혈액에서의 검출 가능성 / 기기에서의 검출 안정성 / 병원에 따른 검출 안정성 등을 고려하여 18개의 바이오마커 마커 패널에 포함될 후보 단백질군을 선별하였다. 이 단백질들의 조합으로 만들어지는 마커 패널의 진단 성능은, 클러스터 서버를 이용한 기계학습(Machine Learning)법 중 서포트 벡터 머신(Support Vector Machine, SVM)을 이용하여 계산되었으며, 패널의 진단 성능과 실제 진단 제품으로 제작했을 경우의 경제성을 모두 고려할 때 3개 단백질로 이루어진 3-단백질 마커 패널이 가장 적절할 것으로 판단되었다.

다중 반응 모니터링 질량 분석법을 통한 각 혈중 단백질 계측 값으로 3-단백질 마커 패널의 진단 성능을 분석해 본 바, 다양한 3-단백질 마커 패널을 구축할 수 있었는데, 이 중 상용 항체로 구성이 가능한 CA19-9, LRG1, TTR로 이루어진 3-단백질 마커 패널의 경우, 기존의 췌장선암 진단 마커인 CA19-9를 단독으로 사용할 때 보다 진단 정확성(AUROC)과 진단 특이도가 90%일 때의 진단 민감도가 모두 10% 이상 유의미하게 상승한 것을 확인할 수 있었다. (진단 정확성은 DeLong의 방법을, 진단 민감도는 McNemar의 방법을 이용할 경우 모두 p-value < 0.05 수준) 이 성능은 다중 반응 모니터링 질량 분석법을 통한 혈중 단백질 계측만이 아닌, Roche社의 대형 진단 기기를 이용한 경우 계측 값을 사용했을 때와 효소면역분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)을 이용한 계측 값을 사용했을 때에도 진단의 성능은 재현되었으며, 그 통계적 유 의미성 또한 유지되었다. 또한, 해당 패널은 정상군과 췌장선암군의 구별 외에, 정상군과 조기 췌장선암군(1/2기), 다른 암종군(유방암, 대장암, 갑상선암)과 췌장선암군, 췌장 양성질환군과 췌장선암군, 기존의 췌장선암 바이오마커인 CA19-9가 정상이라고 판단하는 상황(CA19-9 < 37 U/ml)에서의 췌장선암 진단 성능 모두에서 기존의 췌장선암 바이오마커인 CA19-9 대비 유의미하게 향상된 진단 성능을 보여주었다.

이를 통해, 우리가 대규모 혈액 샘플에서 발굴하고 검증한 다중 단백질 마커 패널은 췌장선암의 조기 발견에 임상 적용 가능성을 가지고있다는 것을 확인할 수 있었다.

The early detection rate of pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is very low due to its high mortality and asymptomatic nature. Most PDAC patients die within 1 year after initial diagnosis, and only 7% survives over 5 years. Most of PDAC patients (about 80%) have almost no symptoms at the early stages and this leads to poor prognoses. The only actual treatment is surgical resection. The purpose of this study is to find out the biomarker panel which can detect early stages of PDAC by complementing the existing PDAC biomarker, CA19-9. We had collected over 1000 plasma samples from 5 big hospitals in Korea (National Cancer Center, Seoul National University Hospital, Samsung Medical Center, Asan Medical Center, Yonsei Severance Hospital) and 1 health examination center (Seoul University Hospital Healthcare System Gangnam Center) to discover / verify / validate biomarkers for early diagnosis of PDAC First, we established 1000 biomarker candidates. About 500 biomarker candidates were screened by bioinformatic methods (construction and analysis of disease networks, weighting, priority setting, etc.) through literature review and database searching and about 500 more marker candidates were selected by cell microarray experiments. Using the multiple reaction monitoring mass spectrometry (MRM-MS), we filtered the biomarker candidate proteins to have potential diagnostic power and stability in detection. The diagnostic performance of the marker panel made by combining these proteins was calculated using Support Vector Machine (SVM) on cluster servers. Considering the diagnostic performance and the economic efficiency of the panel, we concluded that triple marker panel is the most appropriate. Analyzing the diagnostic performance of the triple marker panel by measuring the amount of each protein in blood using MRM-MS, we constructed various triple marker panels. In the case of the triple marker panel consisting of CA19-9, LRG1 and TTR, which can be composed of commercial antibodies, the diagnostic accuracy and diagnostic sensitivity (when specificity = 90%) were both increased by more than 10% of those of CA19-9 (DeLong's method for diagnosis accuracy and McNemar's method for diagnostic sensitivity, p-value < 0.05). This performance was confirmed not only by MRM-MS but also by Roche's machine and by the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). This confirms that the triple-marker panel we have identified and verified in large-scale sample set has clinical applicability in the early detection of PDAC.