Cre에 의존적인 방식으로 RNA 간섭 및 형광표지를 구현할 수 있는 바이러스성 운반체의 개발

Abstract

여러 가지 Cre mouse strain을 이용한 Cre-lox technology는 특정 세포의 기능을 관찰 또는 조절을 가능하게 한다. 이미 여러 연구 그룹에서 Cre에 의존적인 RNA 간섭을 구현할 수 있는 tool들을 개발하였지만 넉다운이 된 세포와 그렇지 않은 세포를 구분할 수 없다는 한계가 있었다. 이 논문에서는 TATAlox와 double-floxed inverted open reading frame (DIO) 을 조합하여 Cre가 발현되는 세포에서 RNA 간섭과 형광단백질 발현이 동시에 가능하도록 하는 바이러스성 운반체 (pAAV-EF1a-DIO-TATAlox-EYFP-U6) 를 개발하였으며, 감정에 대한 학습과 신경질환에 밀접한 관련이 있다고 알려져 있는 dopamine D4 수용체 (D4R) 를 넉다운에 대한 target 유전자로 선정하여 검증을 하였다. D4R에 대한 효과적인 RNA 간섭이 검증된 D4R shRNA를 pAAV-EF1a-DIO-TATAlox-EYFP-U6에 넣고 AAV를 만든 후 세포주에서 검증을 한 결과 D4R의 넉다운과 EYFP 발현은 Cre를 발현하는 세포에서만 일어난다는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 이 바이러스성 운반체를 이용하면 형광신호를 통해 RNA 간섭이 일어나는 세포를 표지하여 연구할 수 있다. 뇌뿐만 아니라 다른 여러 기관에도 다양한 종류의 세포가 존재하는 것을 고려했을 때 이 tool은 신경 회로에서 특정 기능을 수행하는 신경세포를 유전학적으로 좀 더 세분화하여 연구하는데 도움을 줄 뿐만 아니라 생물학의 다른 분야에서 세포의 종류를 구분하여 특정 유전자의 기능을 연구할 때에도 큰 도움이 될 수 있을 것이다.

Cre-lox technology with diverse Cre mouse strains has enabled cell-type-specific monitoring or manipulation. Although several groups have reported DNA constructs for Cre-dependent knockdown (KD), they have not been applicable to visualize shRNA-expressing cells for characterization of them with experiments such as patch clamp recording and fluorescence activated cell sorting (FACS). Here, I developed a viral vector (pAAV-EF1a-DIO-TATAlox-EYFP-U6) for both KD and fluorescent protein expression in Cre-expressing cells by combining the TATAlox-based shRNA transcription system and the double-floxed inverted open reading frame (DIO) technique. As a target gene, the dopamine D4 receptor (D4R) was selected because of the important roles of the D4R in emotional memory and neuropsychiatric disorders. D4R shRNA that had been validated in Cre-independent knockdown test was cloned into pAAV-EF1a-DIO-TATAlox-EYFP-U6 for the generation of recombinant adeno-associated virus (rAAV). rAAV2-EF1a-DIO-TATAlox-EYFP-U6-shD4R infection led to D4R depletion and enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) expression only in Cre-expressing cells. Considering the heterogeneity of microenvironments in many different organs, this tool would not only facilitate studies of gene functions in a specific type of cells in the desired brain region but also be very useful for studies in various biological fields such as cell biology and immunology.