Development of High-Resolution CE-SSCP Analysis System Using PEO-PPO-PEO Triblock Copolymer

Abstract

This thesis is about development of high-resolution capillary electrophoresis-single strand conformation polymorphism (CE-SSCP) analysis system, by using poly(ethyleneoxide)-poly(propyleneoxide)-poly(ethyleneoxide) (PEO-PPO-PEO) triblock copolymer. Unlike conventional CE which separate the target DNA by the mobility difference from molecular weight, CE-SSCP is a DNA separation method based on folding structure diversity of single strand DNA (ssDNA) fragments. By this feature, CE-SSCP analysis can separate DNA fragments with identical length by simple heat denaturing and snap cooling if they have different sequences. CE-SSCP analysis has been applied for genetic variation detection. However, low resolution of conventional CE-SSCP system limited its wider application. Most important factor determining resolution in the CE based analysis system is polymer matrix, which interact with the DNA fragment directly. For the high resolution, ideal polymer matrix should have small pore size for sieving DNA and dynamic coating ability for reducing electroosmotic flow (EOF). PEO-PPO-PEO is an ideal candidate, by which not only small pore size but also dynamic coating ability can be obtained because it forms micellar cubic structure and strongly interacts with silica capillary inner surface. By these features, high resolution CE-SSCP analysis system was constructed by intensive optimization of PEO-PPO-PEO polymer matrix. PEO-PPO-PEO has special physical properties including i) various molecular weights and ethyleneoxide ratio, ii) micellar cubic structure formed in aqueous solution, and iii) viscosity-adjustable property by temperature adjustment. In this dissertation, optimizations based on above properties of polymer matrix for high resolution CE-SSCP analysis were performed. First, optimization based on the PEO-PPO-PEO molecular weight and ethyleneoxide ratio for high resolution of CE-SSCP was performed. By the pathogen 16S rRNA DNA fragment which was not separable in the conventional polymer matrix because of high sequence similarity, high resolution separation condition that can analyze multiple target DNAs were optimized. With this research, high molecular weight and ethyleneoxide ratio of PEO-PPO-PEO showed major effect for the high resolution separation. Next, the effect of internal structure of PEO-PPO-PEO polymer matrix on the separation resolution was investigated. PEO-PPO-PEO forms homogeneous micellar cubic structure in aqueous solution, and has stable internal structure because of hydrogen bonding by hydroxyl end group of PEO. In this study, homogeneity was hindered by the blending of two different PEO-PPO-PEO polymers, and the stability was perturbed by the removal of hydrogen bonding from halogenation of hydroxyl end group. By these approaches, effect of micelle homogeneity and structural stability on separation resolution was revealed. Maintaining the homogeneity and stability was important for the high resolution CE-SSCP analysis. Lastly, the effect of rheological profile of PEO-PPO-PEO polymer matrix on the resolution was investigated. Because the viscoelasticity of PEO-PPO-PEO solution is dramatically changed in the certain temperature range, PEO-PPO-PEO solution shows similar behavior with Newtonian fluid in low temperature while gelated in the high temperature. In the case of PEO-PPO-PEO polymer matrix which had been optimized in the previous studies, this dramatic change is occurred between the room temperature and analysis temperature. Because the temperatures at inlet and outlet ends of capillary are not controllable by the oven, ambient temperature generates temperature gradient in both the ends. In this study, effect of the temperature gradient on resolution of CE-SSCP was investigated for both conventional polymer and PEO-PPO-PEO polymer matrix, and optimal ambient temperature condition was suggested.CE-SSCP analysis system based on the PEO-PPO-PEO polymer matrix developed in this dissertation could provide superior separation resolution compared to the CE-SSCP system using conventional polymer matrix. Moreover, by this DNA analysis system, various genetic analyses such as genetic variation analysis and expression analysis could be developed. Furthermore, by the parameter studies for superior separation resolution, understanding on DNA separation based on single-strand conformations was greatly enhanced.

본 학위논문은 poly(ethyleneoxide)-poly(propyleneoxide)-poly(ethyleneoxide) (이하 PEO-PPO-PEO) 삼중블록공중합체를 이용하여 고해상도 분석이 가능한 모세관 전기영동 기반의 단일쇄 형태변환 다형성 (capillary electrophoresis-single strand conformation polymorphism, 이하 CE-SSCP) 분석 시스템을 개발하는 연구에 대한 것이다. CE-SSCP는 DNA를 길이에 따라 분리하는 일반적인 전기영동기술과는 달리 단일쇄 DNA가 그 서열에 따라 형성하는 3차원적 구조 차이를 이용해 분리하는 기술로, 동일한 길이를 갖는 서로 다른 DNA 단편의 경우에도 그 분리가 간편하게 수행 가능한 장점이 있다. CE-SSCP는 변이 분석 등 다양한 유전자 분석에 활용이 가능할 것으로 기대되었으나, 기존의 CE-SSCP 분석 시스템이 갖는 낮은 분리 해상도로 인해 실제 활용이 제한적이었다. CE 기반 분석 기술에서 분리 해상도를 결정하는 가장 중요한 요소는 DNA단편과 직접적으로 상호작용을 수행하는 polymer matrix로, 이상적인 polymer matrix는 작은 크기의 미세공과 electroosmotic flow (이하 EOF) 감소를 위한 동적 코팅 능력이 요구된다. PEO-PPO-PEO는 미셀로 구성된 입방구조를 통해 극소 미세공의 형성이 손쉽게 가능하며, PEO와 모세관 내벽의 강한 상호작용을 통해 EOF를 감소시킬 수 있는 이상적인 polymer matrix 후보이다. 따라서 본 학위논문에서는 PEO-PPO-PEO의 최적화를 통해 고해상도 CE-SSCP 분석 시스템을 구축하고자 하였다.PEO-PPO-PEO는 1) 다양한 분자량과 ethyleneoxide 비율을 가지며 2) 수용액상에서 미셀로 구성된 입방구조를 형성하고 3) 온도 변화를 통해 쉽게 점도가 조절 가능한 등의 다양한 물리적 특성을 가지며, 본 연구에서는 고해상도 CE-SSCP 수행에 적합한 polymer matrix로 개발하기 위해 위의 특성을 기반으로 한 다각도의 최적화를 수행하였다.먼저 CE-SSCP 분석의 고해상도 달성을 위한 PEO-PPO-PEO의 분자량 및 ethyleneoxide 비율의 최적화가 수행되었다. 서열 유사성이 높아 기존 polymer matrix에서 분리가 어려웠던 병원균 16S rRNA 유전자 마커를 대상으로 수행된 최적화를 통해 10종 이상의 DNA 단편을 높은 해상도로 분리하는 것이 가능함을 확인하였으며, 이를 통해 높은 분자량과 ethyleneoxide 비율을 갖는 PEO-PPO-PEO 삼중블록공중합체가 고해상도 CE-SSCP 분석에 높은 유효성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다. 다음으로 PEO-PPO-PEO가 갖는 내부 구조에 기반을 둔 고해상도 CE-SSCP 분석에 대한 최적화가 수행되었다. PEO-PPO-PEO는 수용액상에서 미셀로 구성된 균질한 입방구조를 형성하는 특징을 가지며, PEO 말단의 수산기가 수소결합을 형성하여 해당 구조의 안정성을 향상시키게 된다. 본 연구에서는 서로 다른 PEO-PPO-PEO의 혼합을 통한 내부구조의 균질성 저해와 수산기의 할로겐화를 통한 안정성 약화를 통해 이의 해상도 영향을 파악하였다. 이를 통해 PEO-PPO-PEO의 균질성 유지 및 수소결합을 통한 안정성 향상이 고해상도 CE-SSCP 분석을 위해 필수적인 요소임을 알 수 있었다.마지막으로 PEO-PPO-PEO의 유동학적 특성에 기반을 둔 고해상도 CE-SSCP 분석의 최적화를 수행하였다. PEO-PPO-PEO수용액은 특정 온도 구간에서 점탄성이 극적으로 변화하여, 낮은 온도에서는 뉴턴유체와 유사한 특성을 갖는 반면 높은 온도에서는 겔화하게 된다. 이전 연구에서 최적화된 PEO-PPO-PEO polymer matrix의 경우 실내 온도와 분석 온도 사이에서 급격한 점탄성 변화가 관찰되므로, 본 연구에서는 온도 조절이 불가능한 모세관 양 말단부에 대한 실내 온도의 CE-SSCP 해상도 영향을 파악하였다. 이를 통해 고해상도 CE-SSCP 분석을 위한 최적 외부 온도조건을 파악할 수 있었다. 본 연구를 통해 얻어진 PEO-PPO-PEO 기반의 CE-SSCP 분석 시스템은 기존의 CE-SSCP에 비해 매우 높은 해상도를 획득 가능하였으며, 이렇게 구축된 고해상도 DNA 분석 시스템을 통해 변이 분석, 발현 분석을 비롯한 다양한 유전자 분석 기술의 향상에 기여할 수 있었다. 또한 본 연구에서 해상도에 영향을 미치는 다양한 요소들이 파악되어, 앞으로의 분리 해상도 향상 연구에 도움을 줄 수 있을 것으로 기대한다.