바이오 응용을 위한 미세 유체 조작

Abstract

미세유체(microfluidics) 기술은 미세액적(microdroplet)을 정밀하게 조작(manipulation)함으로써, 사용되는 샘플의 양을 줄임과 동시에 빠른 시간에 검사를 수행 할 수 있기 때문에, 최근 다양한 생물학적 어세이(biological assay)에 적용하기 위한 연구가 활발히 진행되어 오고 있다. 하지만, 아직까지 판매되고 있는 자동화된 어세이 시스템(automated assay system) 들은 시스템의 작동 및 적용 편의성과 신뢰성 때문에 대부분 실린지 타입(syringe type)의 분주 시스템(dispensing system)을 이용하고 있다. 하지만 이러한 분주 시스템들은 마이크로리터(microliter) 범위에서는 좋은 정밀도(precision)를 보이지만, 나노리터(nanoliter) 범위에서 낮은 정밀도를 보이고 있다. 따라서 본 연구에서는 다양한 어세이 시스템들에 적용하기 편리하면서, 작동 편의성과 나노리터 범위에서 정밀도와 신뢰성이 높은 분주 시스템을 개발하고자 한다. 본 연구를 통해서 제안하는 신개념의 공압(pneumatic) 방식의 분주 시스템은 역류 제지기(backflow stopper)를 이용하여 간단하면서도 효과적인 분주 메커니즘을 개발/적용하여 작동 편의성을 제공하였다. 또한 다양한 분주 범위를 가지도록 쉽게 설계를 변경할 수 있으며, 설계된 분주 범위 내에서는 높은 정밀도와 신뢰성을 가지도록 개발하였다. 또한, 샘플(용액)을 보관하는 저장소와 분주 장치의 일체형의 카트리지(cartridge) 형태의 시스템으로 개발하여 다양한 응용 시스템에 적용하기에 편리하도록 하였다. 미세가공(micromachining) 기술을 이용하여 제작한 디스펜서를 구동하기 위한 공압 컨트롤러를 설계/제작하였으며, 이를 이용하여 다양한 작동 테스트들을 수행하여 본 분주 메커니즘을 확인할 수 있었다. 또한 시스템의 다양한 작동 조전 및 설계 변수가 분주량에 미치는 영향을 측정/분석하였으며, 50 nL 에서 1000 nL 범위에서 높은 정밀도(CV < 1%) 를 확인할 수 있었다. 디스펜서의 다양한 설계 변수와 분주량의 관계를 이해하기 위해서, 집중 변수(lumped parameter)를 이용하여 디스펜서를 모델링(modelling) 하였다. 다양한 설계 변수(챔버 및 노즐의 크기)를 조절한 디스펜서들에 대해서 가해준 압력에 따른 분주량을 계산하고 이를 실험적인 결과와 비교/분석하였다. 이를 통하여, 설계된 디스펜서의 분주 범위를 예측할 수 있었으며, 앞으로 다양한 응용 분야에서 필요로 하는 적절한 분주 범위를 가지는 디스펜서를 설계할 수 있도록 하였다. 또한, 적용 용액의 물리적 특성들(점도 및 표면 장력)이 분주량에 미치는 영향에 대해서 분석하였다. 먼저 글리세롤을 이용하여 다양한 점도를 가지는 용액을 적용하여 점도에 따른 분주량의 변화를 분석하였으며, 그 결과 현재 시스템에서 용액의 점도에 따라 요구되는 압력을 예측할 수 있었다. 앞으로 고점도(high viscosity)의 용액을 적용한 응용 연구에서, 설계 변수의 조절 및 표면 개질 기술을 적용하면 보다 효과적으로 분주할 수 있을 것이다. 그리고 계면 활성제(surfactant)를 이용하여 다양한 표면 장력을 가지는 용액을 적용하여, 본 시스템의 출구(노즐)의 기능과 분주량의 변화를 분석하였다. 게다가 본 시스템의 신뢰성을 확인하기 위하여 다양한 방법으로 분주 성능(반복 정밀도 및 정확도)을 분석하였으며, 다양한 실험들을 통하여 높은 반복 정밀도 (CV < 0.5%) 및 정확도(SE < 1%)를 확인할 수 있었다. 개발 분주 시스템을 인쇄 전자 및 바이오 분야에 활용하기 위해서, 미세 입자 및 세포를 적용하여 분주 특성을 분석하였다. 먼저 미세 입자를 포함한 용액을 적용하여 분주된 입자의 수 및 입자의 부피율을 입자의 농도 및 시스템의 작동 조건들에 대해서 정량적으로 분석하였다. 그 결과 입자의 농도 및 압력에따라 입자의 수가 일정하게 증가하였으며, 각 농도별 입자의 부피율을 일정하게 유지하는 것을 확인 할 수 있었다. 다음 실제 세포(mouse fibroblast)를 적용하여 시스템이 세포에 미치는 영향에 대해서 분석하였다. 먼저 분주 직후 세포의 생존율(viability)을 분석한 결과 80% 이상의 생존율을 확인하였으며, 세포 증식(proliferation)에 대해 분석한 결과 대조군(control group)과 유사한 비율로 증식하는 것을 확인 할 수 있었다. 앞으로 개발한 분주 시스템의 분주 범위를 피코리터 범위까지 줄이고 사출 성형과 같은 대량 생산 가능한 제작 방법으로 시스템의 부품들을 제작한다면, 다양한 기능성 재료들(functional materials)을 적용한 미세제조 도구(micro-fabrication tool)로써 효과적으로 활용될 수 있을 것이다. 이를 위하여 디스펜서의 설계 변수 최적화 및 특성 분석에 대한 연구가 필요할 것이다.

This dissertation presents a novel pneumatic dispensing system with an integrated backflow stopper, and its applications. The dispensing system uses a simple yet effective mechanism with a backflow stopper, so it is both easy to operate and disposable. The unique design comprises the backflow stopper inside the dispenser which functions as a flow restrictor. A thin flexible membrane with precisely controlled pneumatic actuation is used to produce various droplet volumes. Using the custom-built pneumatic controller, the dispensing mechanism has been confirmed, by virtue of various operating tests, to dispense liquid droplets.To provide convenience and separate usage of various samples, we modified an existing dispensing system to the cartridge-type, which has an integrated dispensing part and liquid reservoir. The detailed fabrication is explained, and systematic characterization verified the performance of our device. Our tests provide a range of droplet volumes from 50 nL to 1000 nL at different operating conditions and design parameters.To further understand the behavior of the pneumatic dispenser, we also developed a simple dynamic model of the dispenser, using lumped parameters. Using the equation for the dispensed volume and applied pressure, we can anticipate a droplet volume range for the dispenser.In addition, we evaluate the effects of liquid properties (i.e., viscosity and surface tension) on dispensed droplet volume. We confirmed the relation between the liquid viscosity and the droplet volume using glycerol solutions of different concentrations. Also, we confirmed the capillary valve function of the outlet in our dispenser, and the effects of the surface tension and inlet pressure on the dispensed droplet volume. Furthermore, through tests for repeatability of the dispensing system with various measuring methods, the stability and reliability of our dispensing system was confirmed.To verify the feasibility of using this system to fabricate biomaterials, we conducted tests for dispensing micro-particles and living cells using our system. Particle-suspended liquid droplets were dispensed and analyzed quantitatively at various particle concentrations and system operating conditions. As the applied positive pressure increased, the number of particles per droplet increased consistently, and the volume fraction of particles remained constant. Also, living cells (i.e., mouse fibroblasts) were dispensed with different dispensing pressures in order to evaluate the effect of the dispensing process on cell viability and proliferation. Based on the results of a live-dead assay, more than 80 % of cell viability was confirmed, which was reasonably similar to that in the control group. Furthermore, measurement of cell metabolic activity after dispensing confirmed that the dispensed cell proliferated at a rate comparable to that of the control group. These results demonstrate that the pneumatic dispensing system is a promising tool for the fabrication of biomaterials.