In utero Electroporation-based Neurodevelopmental Disease Modeling

Abstract

유전자 서열 분석 기술의 발달과 함께 질병에 대한 유전학적 접근을 통한 진단 및 치료 가능성을 연구할 수 있는 새로운 장이 열리고 있다. 기술 발전으로 말미암아 새로운 질병 후보 유전자가 빠른 속도로 증가하고 있으며, 모든 유전자에 대해 일일이 유전자 변형 생쥐 모델을 생성하는 것은 굉장히 오랜 시간을 소요한다. 자궁 내 전기천공법(in utero electroporation)은 빠르고 손쉽게 발달 과정의 생쥐 배아에게 세포 종류와 위치에 특이적으로 DNA 를 전달하는 기술이다. 이러한 장점을 가진 자궁 내 전기천공법을 활용하여 조기 발병형 임상 소견을 보이는 강직성 유전성 하반신 마비(early-onset hereditary spastic paraplegia) 환자의 후보 유전자를 평가할 수 있는 플랫폼, 그리고 두 번째로 질병의 치료 가능성을 살필 수 있는 시스템을 구축하고자 하였다. 강직성 유전성 하반신 마비를 유발하는 것으로 알려진 유전자를 체성 피질에 대해 도입하였을 때, 발달 결함의 일종인 신경 세포 이동 결함, 엑손 말단 가지형성 및 뇌량 형성 저해를 발견하였다. 이에 더해 실제 병변인 운동 피질을 목표로 유전자를 도입했을 때, 피질 아래로 형성되는 엑손 묶음 관찰을 통해 조직학적 분석을 통한 유전자 선별 플랫폼의 가능성을 확인했다. 두 번째 목적인 질병의 치료 가능성을 살펴보기 위한 시스템을 구축하기 위하여 우리는 불활성화 도메인(destabilizing domain)을 도입하였고, 이를 평가하기 위해 실제 대뇌 피질 이형성증 원인 유전자인 PIK3CAE545K를 도입하였다. 하위 신호 전달 경로가 활성화되는 것을 통해서 불활성화 도메인이 원하는 방식으로 유도되지 않는 것을 확인하였다. 종합적으로, 본 연구는 자궁 내 전기천공법을 활용한 희귀 신경 발달 질환 후보 유전자 평가 및 시기별 병리기전 연구에 유용하게 활용될 것이다.

Genetic approaches for rare disease through animal models have expanded diagnosis pools and revealed pathological mechanisms. Here, we applied in utero electroporation (IUE) that allows rapid and region-specific DNA delivery in embryonic mouse brains. Using IUE, we validated risk genes of rare neurodevelopmental diseases and investigate the stage-specific effects of them. Firstly, we established platform to verify early-onset hereditary spastic paraplegia (HSP) candidate genes from pediatric patients. Introduction of human HSP variants into the mice somatosensory cortex by IUE resulted in developmental defects including defective neuronal migration, reduced terminal axonal branching, and a thinned corpus callosum. In addition, we targeted upper motor neurons, primary lesion of HSP, and observed abnormal corticofugal projections. As a second goal, we established system for studying the stage-specific effects of pathogenic proteins by tagging destabilizing domain (DD) that can be stabilized by trimethoprim (TMP) treatment. To evaluate whether DD stabilize tagged protein by TMP administration, we performed IUE of DD-tagged PIK3CAE545K which causes malformations of cortical development. Regardless of TMP treatment, IUE of DD-fused PIK3CAE545K led to increased p-S6 activation and cell size of pyramidal neurons that suggest insufficient degradation by DD. Despite of limitations of the system, our results imply in vivo DD experimental scheme and possibility. Altogether, this study helps to broad application of IUE for verifying candidate genes of rare disease and stage-specific pathologies.