Plug-in repressor library for precise regulation of metabolic flux in Escherichia coli

Abstract

In metabolic engineering, enhanced production of value-added chemicals requires precise flux control between growth-essential competing and production pathways. Although advances in synthetic biology have facilitated the exploitation of a number of genetic elements for precise flux control, their use requires expensive inducers, or more importantly, needs complex and time-consuming processes to design and optimize appropriate regulator components, case-by-case. To overcome this issue, we devised the plug-in repressor libraries for target-specific flux control, in which expression levels of the repressors were diversified using degenerate 5’ untranslated region (5’ UTR) sequences employing the UTR Library Designer. After we validated a wide expression range of the repressor libraries, they were applied to improve the production of lycopene from glucose and 3-hydroxypropionic acid (3-HP) from acetate in Escherichia coli via precise flux rebalancing to enlarge precursor pools. Consequently, we successfully achieved optimal carbon fluxes around the precursor nodes for efficient production. The most optimized strains were observed to produce 2.59 g/L of 3-HP and 11.66 mg/L of lycopene, which were improved 16.5-fold and 2.82-fold, respectively, compared to those produced by the parental strains. These results indicate that carbon flux rebalancing using the plug-in library is a powerful strategy for efficient production of value-added chemicals in E. coli.

미생물 발효를 통해 여러 고부가가치 산물을 생산하기 위해서 다양한 대사 공학적 전략이 개발되어 왔다. 생존을 목표로 진화해온 미생물 세포 내부에서는 구성분 합성 및 에너지 대사 등 세포 생장과 관련된 대사 반응이 우선적으로 일어나기 때문에, 특정한 목적 화합물을 다량으로 생산하기 위해서는 대사 회로의 개량 과정이 필수적이다. 이를 위해서, 생산 경로의 선형 증폭을 통해 목적 물질까지의 관련 유전자를 과발현 해줄 수 있고, 경쟁 대사 경로의 제거를 통해 부산물 합성을 최소화할 수 있다.하지만, 목적 화합물의 생산 경로가 세포 생장 관련 대사 반응과 경쟁 관계에 있다면, 생산 경로의 단순한 증폭 및 제거보다 더 섬세한 대사 흐름의 재분배 과정이 요구된다. 대사 흐름이 과도하게 세포 생장 관련 대사 반응에 집중된다면 세포의 목적 화합물 생산성이 낮아지게 되고, 반대로 목적 화합물 생산 경로로 과도한 대사 흐름이 분배된다면 단일 세포의 생산성은 높아질 수 있으나 세포 생장이 저해됨에 따라 체적 생산량이 감소하게 된다. 이러한 관점에서 세포 내의 대사 흐름을 재분배 하기 위해 다양한 전략이 활용되어 왔다. 특히, 다양한 미생물 유래의 조절유전자와 작동유전자가 발굴되면서 조절단백질의 발현량에 따라 목적 유전자의 전사를 억제하는 전략이 활발히 적용되고 있다. 본 연구에서는 이러한 조절유전자과 작동유전자를 차용하여 조절유전자의 발현량을 다양화한 라이브러리를 구축한 후, 대사 흐름 재분배를 위한 목적 유전자의 전사 조절에 활용하고자 하였다. 조절유전자의 발현량은 5’ 비번역영역의 염기서열을 엔지니어링하여 다양화해주었고, 목적 유전자의 프로모터에 작동유전자를 삽입함으로써 직교적인 전사 억제가 일어나도록 하여 이를 ‘플러그 인’ 방식의 전사 억제 단백질 라이브러리로 명명하였다. 5’ 비번역영역의 염기서열에 따라서 다양한 양의 조절단백질이 발현되면 목적 유전자의 전사 과정 또한 다양한 수준으로 억제되고, 생장 관련 대사 반응과 목적 화합물의 합성 사이에서 대사 흐름의 분배가 최적화된 균주에서 가장 높은 생산성을 가질 것으로 기대하였다.