일산화탄소를 고부가가치 화합물로 안정적으로 전환하기 위한 미생물 발효 공정 개발

Abstract

Carbon monoxide (CO) is a promising carbon source due to its enormous abundancy in by-product gas generated from steel mill. Despite of its large potential as a next-generation carbon source, the current use of CO involved in the by-product gas is wasteful; most of the CO gas is being spent by oxidization to CO2 prior to the emission to the air. Thus, it is necessary to develop the platform technology for creating high added value from CO. In this regard, there has been much effort to produce value-added chemicals from CO by adopting naturally CO-utilizing microorganisms, however, it has been still challenging due to difficulties in genetic engineering of the CO-metabolizing microorganisms, and more importantly, low CO consumption stability. In this study, overcoming these issues, a microbial fermentation process which enables efficient and stable production of value-added chemicals from CO has been developed. The followings are summarized contents in this study. First, a platform microbial fermentation process which efficiently produces valuable chemicals (3-hydroxypropionic acid and itaconic acid, respectively) from CO was developed by designing synthetic microbial consortia consisting of Eubacterium limosum and genetically engineered Escherichia coli. During the co-culture, E. limosum utilized to produce acetate, while E. coli metabolized acetate as a sole carbon source. To facilitate the efficient conversion of the assimilated acetate to target products, genetically engineered E. coli strains are required. To this end, E. coli strain producing 3-HP from acetate was developed in this study, while ITA-producing strain was obtained from previous study. When E. limosum and the engineered E. coli were co-cultured, the mutualistic interaction between them occurred by removal of a toxic intermediate, acetate, in E. coli dramatically stabilized and improved CO consumption of E. limosum compared to monoculture. Consequently, the enhanced CO consumption facilitated successful production of 3-HP and ITA from CO. This study was the first demonstration of value-added biochemical production from CO using a microbial consortium. Moreover, it suggests that synthetic mutualistic microbial consortium can serve as a powerful platform for the valorization of CO. Second, a novel strategy using cellulose nanocrystal coated with a tannic acid-Fe3+ complex (Ta-Fe3+CNC) was applied to the CO-based microbial fermentation to reduce the toxicity of CO. It is known to CO affects to cellular respiration, DNA replication, and energy production in microorganisms, leading to the shortening of cell longevity. Although the toxicity of CO against microorganisms has been considered as a main bottleneck which causes the instability of CO, studies for circumventing the toxicity of CO have been very limited. To overcome this issue, a Ta-Fe3+CNC capable of capturing the CO was exploited. The CO toxicity is derived from the remaining dissolved CO in media which has not been metabolized by microorganisms under high CO pressure condition. Thus, its capturing with the nanocrystal would effectively reduce the effect of CO toxicity on the microorganisms by preventing the dissolved CO affecting cell viability. Moreover, in order not to interrupt the microbial CO consumption, affinity of the Ta-Fe3+CNC for CO should be lower than that of the microbe for CO. When the Ta-Fe3+CNC was applied to the culture of E. limosum, it was observed that the Ta-Fe3+CNC significantly relieved the substrate inhibition of CO and did not show negative effect on the microbial CO consumption activity. Furthermore, the tolerization of CO against the microorganisms could enable more stable microbial fermentation for the CO conversion. It indicates that the buffering of CO toxicity using CO-capturing Ta-Fe3+CNC could be a platform technology for the stable and efficient microbial fermentation for CO bioconversion.

일산화탄소는 제철소나 석유 가공 공정에서 생산되는 부생 가스에 풍부한 탄소원으로써, 차세대 탄소원으로 각광받고 있다. 예를 들어, 제철소에서 1 톤의 철을 생산하는 과정에서 2.5-3.5 톤의 고로가스가 발생되며, 이 가스는 약 28% 수준의 일산화탄소를 함유하고 있다. 2017년 기준 세계적인 철 생산량이 약 16.9억 톤인 점을 감안하면, 제철소로부터 막대한 양의 일산화탄소가 생산되는 것을 알 수 있다. 하지만, 이러한 풍부한 양에 있어서의 장점에도 불구하고, 현재 제철소에서 발생하고 있는 일산화탄소의 활용은 주로 단순 산화를 통한 전력 발생 수준에 머무르고 있으며, 이 과정에서 만들어지는 이산화탄소의 대기중 방출은 온실효과를 유발한다는 점에서 환경적인 문제 또한 발생시킨다. 이러한 현재의 일산화탄소 활용에 있어서의 문제점을 극복할 수 있는 방안으로 최근 각광을 받고 있는 방법이 미생물을 활용한 일산화탄소의 생전환이다. 자연계에는 많은 종류의 E. limosum이나 C. aceticum과 같은 다양한 종류의 초산 생성균들이 존재하며, 이들은 일산화탄소를 단일탄소원으로 활용할 수 있다고 알려져 있다. 이러한 사실에 입각하여, 초산 생성균들은 일산화탄소의 생전환을 위한 공정에 활용되어 왔으며, 실제로 acetate나 butyrate, ethanol, butanol과 같은 목적화합물들의 일산화탄소 유래 생산이 보고된 바 있다. 하지만, 이러한 목적화합물들은 acetone, isopropanol 및 3-hydroxybutyrate와 같은 몇 가지 사례를 제외하고는 주로 자연적으로 생산될 수 있는 대사 산물에 한정되어 왔으며, 이는 해당 균주들의 유전적 개량에 있어서의 어려움 때문으로 여겨진다. 이러한 문제를 해결하기 위한 방안으로써 유전적 개량이 매우 용이한 대장균과 같은 플랫폼 균주들을 활용할 수 있지만, 플랫폼 균주의 경우 CO 대사 균주들과 생리학적 특성이 크게 다르기 때문에 일산화탄소 대사 회로의 도입이 매우 어려운 것으로 알려져 있다. 더불어, 일산화탄소가 가지는 미생물에 대한 독성은 일산화탄소 기반의 안정적인 미생물 배양 공정을 개발하기 위해서 해결해야 할 또 다른 문제점으로 여겨진다. 그 동안은 CO의 독성으로부터 받는 영향을 피하기 위해서, 배지 내 용존 일산화탄소 농도가 최소화되는 물질 전달 제한 조건에서 공정을 운영해 왔지만, 해당 조건은 높은 세포 농도를 필요로 하기 때문에 균주의 대사 활성을 랜 시간 동안 안정적으로 유지하기 어렵다는 한계점이 있다. 또한, 시간에 따라 감소된 일산화탄소 대사 활성은 용존 일산화탄소 농도의 증가를 유발하여 세포 수명의 단축을 가속화시키기 때문에 공정의 더욱 심각한 불안정성을 초래한다. 따라서, 일산화탄소 기반의 효율적이고 안정적인 생전환 공정을 개발하기 위해서는 앞서 언급한 한계점들을 모두 극복할 수 있는 새로운 접근이 필요하다. 이에 본 연구에서는 일산화탄소로부터 다양한 부가가치 화학물질을 안정적이고 효율적으로 생산할 수 있는 새로운 개념의 미생물 발효 공정을 개발하고자 하였다. 이를 위해 기존의 단일 균주 개량을 통한 super-bug 접근 방식이 아니라, 합성 미생물 컨소시엄을 활용하는 새로운 전략을 설계하였다. 이 연구의 궁극적인 목표를 성공적으로 달성하기 위해서는 몇 가지의 핵심 요소가 본질적으로 고려되어야 하는데, 첫 번째로, 일산화탄소 대사 활성을 장기간 유지하여 일산화탄소의 독성 영향을 줄이기 위해서는 합성 미생물 컨소시엄의 안정성이 보장되어야 한다. 컨소시엄의 안정성은 주로 미생물 균주 간의 상호 작용에 의해 결정되기 때문에, 본 연구의 목적 달성에 있어서는 미생물 컨소시엄 내 균주 간 적절한 상호 작용들이 형성될 필요가 있었다. 두 번째로 고려되어야 하는 점은 그럼에도 불구하고 발생할 수 있는 일산화탄소의 독성을 저감시키는 것이다. 앞서 언급한 바와 같이 종간의 이로운 상호작용이 미생물 컨소시엄 내에서 형성되었음에도 불구하고 일산화탄소 대사 활성은 영원히 유지될 수는 없으며, 이는 결과적으로 일산화탄소의 독성을 야기한다. 따라서, 독성 효과를 직접적으로 완화하기 위한 새로운 전략이 설계되어야 한다. 본 연구는 앞서 언급한 두 가지 사항을 고려하여 다음과 같이 진행되었다. 먼저, E. limosum (일산화탄소 대사 균주)과 개량된 대장균 (목적 화합물 생산을 위한 플랫폼 균주)를 공동배양하여 합성 미생물 컨소시엄을 개발하였다. 공동 배양 과정에서 E. limosum은 일산화탄소를 대사하여 독성 부산물인 아세트산을 생산하는 반면, 대장균은 이러한 아세트산을 탄소원으로 활용하여 고부가가치 화학 물질인 3-HP와 ITA를 생산한다. 이를 통해, E. limosum은 대장균에게 탄소원을 제공하고 대장균은 E. limosum에게 독성을 가지는 아세트산을 제거해 줌으로써 두 균주는 상호공생 관계를 형성하게 된다. 본 연구에서 형성된 공생적 상호작용은 단일 배양에 비해 E. limosum의 일산화탄소 대사를 극적으로 개선 및 안정화할 수 있음이 관찰되었으며, 이는 결과적으로 향상된 목적화합물 생산성을 확보하는 데에 기여하였다. 본 연구는 전 세계적으로 미생물 컨소시엄을 활용하여 일산화탄소로부터 고부가가치 화학 물질을 생산한 첫 번째 사례이며, 이는 상호공생 관계를 가지는 합성 미생물 컨소시엄이 일산화탄소의 고부가가치화를 위한 강력한 플랫폼 기술이 될 수 있음을 시사한다. 둘 째로, 일산화탄소 유래 독성을 보다 완화하기 위해서 타닌철 복합체로 코팅된 셀루로오스 나노 결정을 활용했다. 타닌 철 복합체는 일산화탄소에 결합할 수 있기 때문에 TA-Fe3+CNC는 배지에 용해된 일산화탄소를 포획해 둠으로써 일산화탄소가 미생물에 부정적인 영향을 미치는 것을 방지할 것이라고 판단하였다. 또한, 적절한 친화력을 기반으로 한 일산화탄소의 가역적인 흡탈착이 가능하다면, TA-Fe3+CNC가 각각 높은 일산화탄소 압력 조건에서는 일산화탄소를 보유하고 낮은 일산화탄소 압력 조건에서는 일산화탄소를 방출하는 것이 가능할 것이며, 이를 통해 TA-Fe3+CNC가 일산화탄소 버퍼로써 작동할 수 있을 것이라고 가정하였다. 이러한 TA-Fe3+CNC의 효능을 확인하기 위해 일산화탄소 대사 균주인 E. limosum의 배양에 적용한 결과, TA-Fe3+CNC의 사용은 E. limosum에 대한 일산화탄소의 독성을 직접적으로 완화시켰으며, 이를 통해 높은 일산화탄소 압력 조건에서 제한되던 E. limosum의 일산화탄소 대사 kinetics가 회복됨을 확인하였다. 더불어, 이러한 일산화탄소의 독성 저감 효과는 전반적인 일산화탄소 대사 안정성의 향상으로도 이어졌다. 본 연구는 TA-Fe3+CNC를 활용한 일산화탄소 독성 저감 기술이 보다 안정적인 일산화탄소의 생전환을 가능하게 하는 강력한 플랫폼 기술임을 시사한다.