기능성 초분자 시스템 개발: 융합 단백질 기반의 접착제, 단백질 의약품 정제 플랫폼

Abstract

This thesis describes (1) the design and synthesis of a fusion protein incorporating two different protein subunits in which one has adhesion properties while the other forms a self-assembled fibril structure, using genetic engineering, and (2) the development of a new platform for affinity based purification of protein therapeutics using a supramolecular latch system consisted of cucurbit[7]uril (CB[7]) and its high affinity guest molecules, adamantylammonium or ferrocenemethylammonium (AdA or FcA; Ka = 10^12 ~ 10^17 M^-1). The supramolecular chemistry provides a new insight to design and produce those functional systems as described below. The general introduction of each research topic is presented in Chapter 1. Chapter 2 describes self-assembled adhesive biomaterials formed by a genetically designed fusion protein which is made up of Mfp3 (a mussel foot protein 3 from Mytilus galloprovincialis) having adhesion properties and MaSp1 (a silk spidroin from Nephila clavipes) formed a well-defined supramolecular structure. The natures of the fusion protein (MS) not only resembled the structural characteristics of MaSp1 but also showed enhanced adhesiveness resulting from Mfp3. This successful incorporation of the wet adhesiveness of Mfp3 into the well-structured assembly of MaSp1 may provide a new insight for the genetic design of underwater adhesive recombinant proteins by utilizing the structural features of a spidroin protein. Chapter 3 presents chemically robust CB[7]-conjugated agarose beads (abbreviated as CB[7] beads) as an affinity based protein purification tool utilizing a supramolecular latching system. The 2nd generation CB[7] beads synthesized by epoxy-ring opening reaction using hydroxyl group on CB[7] and the epoxy group on agarose beads could selectively isolate AdA or FcA conjugated bovine serum albumin (AdA-BSA or FcA-BSA) from a complex cell lysate by taking advantage of the extraordinary host-guest chemistry of CB[7] and AdA or FcA. In addition, the ether linker between CB[7] and agarose bead provided the bead much better chemical and thermal stability and thereby higher performance in protein purification and a longer shelf-life in comparison with the 1st generation CB[7] bead having ester linkers. Chapter 4 delineates the purification of protein therapeutics via supramolecular host-guest interactions. A combination of a sortase-mediated selective AdA conjugation on target protein therapeutics and the robust CB[7] bead enabled the affinity purification of both monoclonal antibody and non-monoclonal antibody protein therapeutics with the host-guest interaction between CB[7] and AdA. In addition, the readily available chemicals for CB[7] bead synthesis and robustness of CB[7] beads made them scalable, sterilisable and recyclable. These CB[7] bead based affinity purification technology may be useful for manufacturing new protein therapeutics as well as biosimilar drugs by saving costs and making them possible for the large scale production.

초분자 화학은 두 개 이상의 분자들이 비공유 결합을 통해 자발적으로 형성하는 구조체 혹은 구조체의 특성에 관하여 연구하는 학문이다. 이는 기존의 합성법과는 다른 방법으로 물질을 합성하고, 합성된 물질의 구성성분에서 나타나지 않던 특성을 응용하여 다양한 기능성 시스템 개발 연구를 가능하게 했다. 특히, Top-down 방식으로 접근하기 힘든 새로운 시스템 혹은 물질의 개발의 경우, 초분자 화학의 핵심 개념인 자기 조립 또는 분자 인지 특성을 기반한 Bottom-up 방식으로 접근하면 비교적 쉽게 개발할 수 있어 초분자 화학을 기반으로 다양한 시스템 그리고 나노, 고분자, 다공성 물질의 개발이 진행되어 왔다. 본 논문에서는 초분자 화학을 바탕으로 개발한 기능성 초분자 시스템들(융합 단백질 기반의 접착제와 단백질 의약품 정제 플랫폼)에 대해 살펴보고자 한다. 발전된 형태의 기능성 시스템 및 소재들은 기존의 단순 합성 형태로 개발하기엔 한계가 있다. 기존 보다 더 발전된 형태의 경우, 더욱 복잡한 구조 혹은 복잡한 과정을 수반할 뿐만 아니라 합성 관점에서 분자 구조를 제어하는 것이 쉽지 않아 미세하게 컨트롤하는 것이 매우 어렵기 때문이다. 초분자 화학적 접근법을 통한 합성의 경우, 분자간 비공유 결합 (수소결합, 반데르발스 결합 등)을 기반으로 프로그램된 구성 성분들을 디자인하여 비교적 단순한 형태로 새로운 혹은 발전된 형태의 특성이 도입된 시스템 혹은 소재를 개발할 수 있다. 챕터 2에서는 자기 조립으로 섬유 형태의 초분자 구조체를 형성하는 단백질에 접착성을 가지는 단백질을 도입하고 이렇게 형성된 융합 단백질을 기반으로 한 접착제 개발하는 연구에 대해 논의하고 있다. 두 단백질이 결합된 융합 단백질을 합성하기 위해 유전자 재조합을 이용하였다. 융합 단백질 기반의 접착제에서 섬유형태의의 구조체가 관찰되었고, 또, 구조체를 형성하는 단백질이 가지는 고유의 탄성도 확인되었다. 이러한 구조체와 탄성을 가지는 융합 단백질은 기존 접착 단백질보다 뛰어난 접착력을 보여주었다. 이러한 형태의 분자 디자인은 새로운 혹은 발전된 형태의 접착제를 개발하는 데 활용할 수 있을 것으로 판단된다. 관심 있는 단백질을 분석하고 분리해내는 기술은 생명 공학 분야의 발전에 큰 기여를 해왔다. 특히, 자연에 존재하는 결합쌍인 아비딘 단백질과 바이오틴은 서로 간에 선택적이며 안정적인 결합(Ka = 10^12~10^15 M^-1)으로 생체물질 분석법 및 정제 기술에 응용되어 왔다. 하지만, 이들은 생체 내에 존재하는 바이오틴에 간섭을 받고 극한 환경(고온, 산염기 pH, 계면활성제, 환원제 등)에서 변질이 되는 단백질이 포함된 결합쌍이어서 종종 부정확한 분석 결과를 야기한다. 쿠커비투릴(Cucurbit[n]uril, CB[n])은 글라이콜우릴과 포름알데하이드의 산촉매 축합 중합 반응으로 합성되는 유기 고리 분자이다. 특히, 7개의 글라이콜우릴로 구성된 CB[7]은 소수성 상호작용과 이온-쌍극자 상호작용을 통해 아다만탄 암모늄, 페로센 암모늄과 선택적이고 강한 결합력(Ka = 10^12~10^17 M^-1)을 가지는 쌍을 이룬다. 또, 이들은 극한 환경에서도 형태를 안정적으로 유지하여 아비딘-바이오틴 쌍과 같은 자연에 존재하는 시스템을 보완 가능한 인공 결합쌍으로 응용되어 왔다. 이어지는 챕터들에서는 이러한 독특한 인공 결합쌍을 이용하여 구현한 단백질 정제 기술에 대해 이야기하고 있다.. 챕터 3에서는 본 연구실에서 선보였던 CB[7]-고분자 비드가 단백질 정제 기술로 보여준 잠재력을 발전시키기 위한 연구를 보여준다. 먼저 초기 형태의 CB[7]-고분자 비드 (1세대 CB[7] 비드)는 기능적으로 뛰어났지만, CB[7]과 비드 사이 연결부분에 가수분해가 일어나 안정적으로 기능을 유지하지 못하여 다양한 응용 연구를 하는데 한계가 있었다. 이를 극복하기 위해 기존 1세대 CB[7] 비드에서 사용된 에스터 작용기를 에테르 작용기로 대체하고자 하였다. CB[7]에 도입된 하이드록시 작용기와 고분자 비드에 도입된 에폭시 작용기의 에폭시 고리열림 반응으로 CB[7]와 고분자 비드를 에테 작용기로 성공적으로 연결하였다. 이렇게 합성된 2세대 CB[7] 비드는 극한의 실험 환경(고온, 산/염기 pH, 계면활성제 혹은 환원제에 노출된 환경)을 거친 후에도 성능이 유지되어 이를 이용한 다양한 응용 연구가 진행될 것으로 생각된다. 마지막으로 챕터4에서는 챕터 3에서 연구한 2세대 CB[7] 비드를 이용하여 단백질 의약품 정제 플랫폼으로 응용하는 연구에 대해 소개한다. 뛰어난 효능과 안정성으로 단백질 의약품은 수요가 높았지만 그들의 높은 가격으로 많은 환자에게 쉽사리 공급되지 못하였다. 정제 과정 중 고가의 Protein A 기반의 정제 공정이 단백질 의약품의 가격을 높이는데 크게 기인하였고 이를 극복하기 위한 대체 정제 기법으로 CB[7] 비드 기반의 플랫폼을 이용해보았다. 먼저, 유전자 재조합으로 합성된 목적 의약품 단백질에 효소Sortase 를 이용하여 아다만탄 암모늄을 선택적으로 도입하였고, 이후 2세대 CB[7] 비드를 이용하여 혼합물 속의 목적 의약품 단백질을 포집할 수 있었다. 이러한 형태의 CB[7] 기반 정제 기술은 기존에 의약품 산업에서 사용되던 Protein A기반의 기술보다 많은 양의 단백질을 정제하였다. 이 기술은 재사용성과 안정성을 갖추고 있고, 또, 다양한 단백질 의약품에 적용할 수 있는 범용성도 가지고 있어 기존 기술을 대체할 가능성이 있는 경제적인 기술이 될 것으로 판단된다. 뿐만 아니라 이 기술은 기초과학과 산업 분야를 잊는 징검다리 형태의 연구 사례로도 가치가 있을 것으로 생각된다.