순차적 4중 힘 매핑으로 아밀로이드-베타와 알파-시누클레인 혼합물에서 생성된 나노 응집체의 구조분석

Abstract

알츠하이머 질환 및 파킨슨 질환은 대표적인 퇴행성 뇌 신경 질환이다. 각각의 질환은 아밀로이드-베타 단백질의 응집으로 나타나는 플라그(plaque)와 알파-시누클레인 단백질의 응집으로 나타나는 루이소체(lewy body)라는 병리적 특성을 갖는다. 특히, 많은 비율의 환자들에게서 아밀로이드-베타 응집체와 알파-시누클레인 응집체가 동시에 발견 되는 중첩 현상을 보이는데, 이러한 병리적 중첩을 나타내는 환자군들은 기존의 단일 질환 환자들 보다 질병의 진전 속도가 더 빠르고 예후가 좋지 않은 것으로 보고되고 있다. 이에 따라 아밀로이드-베타와 알파-시누클레인의 공동 응집(co-aggregation) 가설이 대두되었지만, 지금까지 단일 응집체 수준에서 두 단백질의 공동 응집을 규명하기엔 기술적 한계가 있었다. 이를 극복하기 위해 본 연구는 원자 힘 현미경 (atomic force microscopy, AFM)을 이용하여 단백질 올리고머의 표면 구조를 단일 응집체 수준에서 관찰하였다. AFM 은 광학 집게 (optical tweezer), 자석 집게 (magnetic tweezer)와 더불어 단분자 힘 분광학 (single molecule force spectroscopy, SMFS)을 대표하는 기술이다. 단분자 수준의 힘을 측정하고 응용하는 기술로, 이를 기반으로 아밀로이드-베타와 알파-시누클레인 각 펩타이드의 말단을 특이적으로 인식하는 항체 4종류를 AFM 팁에 고정하여 단일 응집체 표면에 4중 힘 지도화를 수행하였다. 본 논문의 제 1장에서는 AFM의 기술과 그 응용에 초점을 맞추어 일반적인 작동 모드와 그 원리를 설명한다. 더불어 생분자 분석을 위한 기능성 계면의 제조 방법과 응용 사례들을 소개한다. 이어 제 2장에서는 아밀로이드-베타 및 알파-시누클레인의 공동 응집 산물인 헤테로-올리고머의 표면을 4 중 힘 매핑하는 방법을 설명하고, 실험 결과들을 정리 한다.

제 1 장: 원자 힘 현미경-단일 분자 분석을 위한 기술 단일 분자 분석 기술은 생물학 시스템에서 분자들의 동적 과정과 단일 분자 간의 상호 작용 및 환경을 조사하는데 중요한 역할을 하고 있다. 특히, 원자 힘 현미경(AFM)은 나노미터(nm)의 위치 정확도와 피코뉴턴(pN)의 힘 감도를 갖기 때문에 단일 생체분자의 구조 및 기능 조사에 각광을 받는 기술이다. AFM은 생체 분자 구조의 형태적 배열을 관찰하고 상보적인 분자 쌍 간의 결합력 및 비결합력을 측정할 수 있을 뿐 아니라, 개별 분자의 분포를 매핑함으로써 분자 표지 과정 없이도 단일 분자의 정량화를 가능케 한다. 그 밖에도 기질의 국부적 탄성, 단일 분자 상호작용의 동역학 및 열역학에 대한 정보 수집 할 수 있다. 원자 힘 현미경을 이용하여 단분자간의 힘을 측정하기 위해서는 적합한 표면 준비가 동반한다. 특히 단일 분자의 거동을 분석하기 위해서는 고정화된 분자간의 입체 장애 (steric effect)를 감소시킬 수 있도록 표면에 도입되는 분자들의 밀도가 낮아야 한다. 본 논문에서 사용한 덴드론 (Dendron) 박막 제조 기술은 고정화한 표적 분자의 활성을 유지시키면서 분자간 간격을 나노 미터 수준으로 조절하여 입체 장애 효과를 감소 시킬 수 있도록 정립되었다. 일정한 크기의 가지가 뻗어나가는 형태를 갖는 덴드론 분자는 세대에 따라 그 크기를 조절 할 수 있기 때문에 표적 분자의 크기에 따라 원하는 간격으로 배열 시킬 수 있는 장점을 가지고 있다. 이를 이용해 다양한 생체 분자를 도입하고 높은 효율로 단일 분자간의 상호작용력을 측정할 수 있다.

제 2장: 아밀로이드-베타 및 알파-시누클레인에서 형성 된 이종 올리고머의 고해상도 4중 힘 매핑 알츠하이머 질환과 파킨슨 질환의 중첩은 아밀로이드-베타 및 알파-시누클레인에서 파생 된 헤테로-올리고머 형성과 관련이 있다. 그러나 지금까지 헤테로-올리고머의 구조적 특성은 특히 고해상도에서 규명되지 않았다. 따라서 본 연구는 원자 힘 현미경(AFM)을 이용해 헤테로-올리고머의 표면 구조를 각 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단을 인식하는 항체가 고정 된 4개의 AFM 팁으로 조사하였다. 4종류의 AFM 팁을 이용한 순차적 4중 추적을 통해 단일 응집체 표면에 각 펩타이드가 인식된 자리를 지도화 하였으며, 동일한 자리의 올리고머를 연속적으로 추적하기 위해 그리드-슬라이드 기반 같은 위치 찾기 방법을 고도화 하였다. 그 결과 아밀로이드-베타와 알파-시누클레인의 공동 응집 산물인 헤테로-올리고머의 표면 구조를 단일 응집체 수준에서 규명할 수 있었다. 각 펩타이드의 N-말단과 C-말단은 모두 헤테로-올리고머 표면에 노출 되었으며, 올리고머의 크기가 커질수록 각 펩타이드의 말단을 인식하는 확률 또한 높아졌다. 또한 헤테로-올리고머의 경우 펩타이드 말단을 인식 할 확률이 호모-올리고머 보다 더 높다는 것을 확인하였는데, 이 결과는 호모-올리고머 보다 헤테로-올리고머에서 각 펩타이드의 말단이 표면에 위치하는 경향이 더 크거나, 표면에 위치한 펩타이드 말단들이 더 많은 자유도를 가지고 있음을 시사한다. 이것은 호모-올리고머 보다 헤테로-올리고머에서 펩타이드 간 응집이 더 느슨하게 이루어 지는 것으로 확인할 수 있다. 본 연구의 방법론은 단일 분자 수준에서 단백질 응집체의 구조를 나노미터 단위의 수준으로 접근하는 새로운 방식이 될 수 있다. 또한 그 밖의 퇴행성 뇌신경 질환 중첩에 관련 된 헤테로-단백질 응집체의 구조 연구에도 활용될 수 있으며, 알츠하이머 질환의 또 다른 바이오 마커로 알려진 타우 단백질이나, 광우병과 연관 된 프리온 단백질의 응집에 대해서도 동일한 분석 방법을 적용할 수 있다. 따라서 보다 광범위한 퇴행성 뇌신경 중첩 질환을 단일 분자 수준에서 정밀하게 이해할 수 있을 것으로 전망한다.

Chapter Ⅰ. Atomic Force Microscopy: A Facile Approach for Single Molecule Analysis For many biological systems, single-molecule techniques are useful to understand dynamic processes of a molecule or a molecular assembly under investigation and the interaction with its counterpart including the environment in depth. Because of the nanometeric positional accuracy and picoNewton force sensitivity of atomic force microscope (AFM), the tool has been widely employed for the structural and functional investigation of single biomolecules in their native environment. The technique allows us to observe the structural arrangement of the biomolecules and measure binding/unbinding forces between complementary molecular pair. By localizing the individual molecules and counting them in a specific area, AFM can quantify the number of molecules without modification or labeling. In addition, the study with AFM enables us to get information about the local elasticity of a substrate in high lateral resolution, and provides us with thermodynamic and kinetic constants of the single-molecular interaction. In this chapter, single molecule force spectroscopy including AFM and various applications of AFM are introduced. Because we employed a specific coating approach to enhance the reproducibility and the probability of getting one-to-one interaction of the selected tool, chemical processes for the surface control is also introduced.

Chapter Ⅱ. High-resolution Quadruple Mapping of Hetero-oligomers Derived from Amyloid-beta and Alpha-synuclein Overlapping of Alzheimer’s disease and Parkinson’s disease is associated with the formation of hetero-oligomers derived from amyloid-beta and alpha-synuclein. However, the structural identity of the hetero-oligomer has yet to be elucidated, particularly at high resolution. Here, with atomic force microscopy, the surface structure of hetero-oligomer was examined with four distinct AFM tips tethering one of the selected antibodies recognizing N-terminus or C-terminus of each peptide. All aggregates were found to be hetero-oligomers, and probability of recognizing the termini is higher than that for the homo-oligomers, suggesting that the termini of the former have a greater tendency to be located at the surface or the termini have more freedom to be recognized, probably through loose packing. The methodology in this study provides us with a new approach to elucidate the structure of such aggregates at the single-molecule level, allowing the exploration of other intrinsically disordered proteins frequently found in nature.