NIR-II Fluorescence Imaging System and Quantum Dot-Based Imaging Probes for Multiplexing

Abstract

Fluorescence (FL) imaging is a powerful modality that can provide ample chemical and biological information with many advantages such as high sensitivity, non-iodizing radiation, relatively low cost, and high spatial resolution. Imaging in the second near-infrared (NIR-II, 1000-1700 nm) optical window shows reduced light scattering, and therefore FL imaging in NIR-II can achieve deeper tissue penetration than imaging in the visual or conventional NIR-I regions (750-900 nm). This thesis describes the development of NIR-II imaging system in epi-fluorescence system or three-dimensional (3D) configuration, and synthesis, characterization, and application of quantum dot (QD) based NIR-II multiplex imaging probes for small animal in vivo imaging. In vivo NIR-II FL imaging system for deep tissue imaging has been developed, using time-modulated illumination system and image averaging. Time-modulated pulsed laser was synchronized with InGaAs CCD in epi-fluorescence configuration, and able to increase the tissue penetration depth more than twice. Multiple acquisitions of fluorescence images and averaging process pixel by pixel were also performed to overcome the thermal noise issue of the NIR-II detector, which yielded significant enhancement in the imaging capability showing up to 1.5 times increase in the contrast-to-noise-ratio. The results suggest deep tissue penetrating NIR-II fluorescence imaging for numerous applications in biological studies, sensitive diagnoses, and intra-operative surgery guidance. Prototype of multiplexed 3D FL NIR-II imaging system has been suggested using light-sheet illumination technique. The introduction of the NIR-II imaging components into the conventional light-sheet imaging system ensures penetration depths of several mm even in a highly scattering environment similar to skin tissues. The enhancement of the imaging depth allows the non-invasive imaging of the living sample by eliminating the pre-treatment steps required for the conventional light-sheet imaging system such as CLARITY or tissue sectioning. Overall time to scan 20 cm3 of imaging volume was less than 2 minutes, and the 3D NIR-II FL images are well-reconstructed without distortion of the tube thickness or position. NIR-II FL 3D imaging with multiple channel was also available using two NIR-II QD samples and the motorized filter wheel. When the process is made in synchronization of the imaging components, the imaging system could image in real-time or relatively slow, not available in existing NIR-II imaging systems. NIR-II multiplexing may be one of the major intrinsic advantages of FL imaging, but NIR-II probes for multiplexing has been yet almost unexplored. QDs can provide a unique opportunity in NIR-II multiplexing because of their broad absorption profile, tunable emission wavelengths, and bright and narrow-spectrum FL. NIR-II emitting QD probes for multiplexed imaging are showcased and used for in vivo imaging. Optimal synthetic condition of PbS/CdS core/shell QDs has been investigated for narrow fluorescence emission profile and high quantum yield in aqueous condition to such an extent that signals are separated by imaging system. Compact (hydrodynamic size <20 nm), bright (quantum yield >15% in buffers), long-term stable (retaining the size and brightness over a week), and narrow-band-NIR-II-emitting polymer-encapsulated PbS/CdS QDs (PQDs) were achieved. Exploiting the simple bioconjugation capability of PQDs, folic acids are conjugated to PQDs which can efficiently label folate receptor overexpressing cancer cell lines. The PQDs afford multiplexed and nearly real-time longitudinal whole-body in vivo imaging. The NIR-II whole-body imaging with the folic acid conjugated PQDs (FA-PQDs) and unconjugated PQDs provides precise evaluation of the active ligand-assisted tumor-targeting capability of the folic acid because the hydrodynamic size control of the two PQDs effectively eliminates effects from the size-dependent accumulations by permeations and retentions in tumors. Those PQDs for NIR-II multiplexed imaging are expected to provide a research platform for various research topics.

본 논문은 생체 투과 깊이가 깊은 2차 근적외선 영역의 형광 영상화 장비 및 다중 영상을 위한 양자점 프로브의 개발에 대한 결과를 담고 있다. 먼저 2차 근적외선 영역의 평면 형광 영상화를 위한 영상화 시스템을 구축하고, 시변조 레이저의 펄스 여기와 이미지 평균화를 통한 노이즈 제거로 고심도 생체 영상화가 가능함을 보였다. 장비 구성의 간편함 및 향후 의료영상 적용 가능성을 고려하여, 여기 광원과 카메라가 같은 방향에 위치하는 평면 형광 영상화 시스템을 선택하였다. 시변조 레이저와 카메라의 동기화를 통해 레이저 광원의 평균적인 플루언스율을 충분히 낮게 유지하면서도, 형광 이미지를 획득하는 순간의 유효 플루언스율을 높여 유효한 이미징 깊이를 향상시켰다. 2차 근적외선 방출 양자점을 형광 프로브로 이용하고 액체 팬텀, 생체 조직 및 소동물 실험을 통해 지속적인 레이저 여기와 시변조 레이저의 펄스 여기가 동일한 평균 플루언스율 정도에서 유효한 이미징 깊이를 두 배 이상 증가시킬 수 있음을 확인하였다. 또한 2차 근적외선 감지 검출기의 고질적인 열잡음 문제를 해결하기 위해, 형광 이미지를 여러 장 수집하고 픽셀 단위로 평균화하는 과정을 통해 대조대잡음비를 1.5배까지 향상시켰다. 단순한 빛의 투과 깊이가 아닌 영상화 가능 깊이에 대한 고찰을 통하여 단파적외선 양자점을 프로브로 이용한 전신 생체영상에서 고심도 실시간 영상이 가능함을 보였다. 기존 가시광선 영역에서 널리 이용되는 광 시트 현미경 기술을 도입하여, 2차 근적외선 영역에서 3차원 다중 영상을 구현하였다. 광 시트 여기법은 얇은 시트 모양으로 모아진 여기 광원에 의해 여기되는 평면의 형광 정보를 시트에 수직한 방향에 위치한 카메라에서 획득하며, 광 시트가 여기하는 평면의 위치를 옮겨 가며 전체 부피를 스캔하며, 최종적으로 모든 평면 형광 정보를 수합하여 3차원적인 형광 정보를 재구축한다. 이러한 시스템은 공초점, 다광자 이미징 등의 다른 3차원적 형광 이미징 기술보다 빠르게 3차원적인 정보를 얻을 수 있다는 장점이 있다. 구현된 2차 근적외선 광 시트 이미징 시스템의 프로토타입은 2차 근적외선 파장대의 적은 산란 특성으로 인해, 가시광선 영역의 광 시트 이미징 기법에서 사용하는 조직 전처리 등의 과정 없이 생체 피부 조직과 비슷한 산란 조건에서도 수 mm의 이미징 깊이를 얻을 수 있었다. 또한 두 종류의 서로 다른 파장을 가진 2차 근적외선 형광체 신호를 광학 필터로 분리하여, 성공적으로 3차원 다중 영상을 구현할 수 있었다. 개발된 2차 근적외선 광시트 이미징 시스템은 기존의 3차원적 형광 이미징 기술과 차별화되는 높은 시간 분해능을 이용하여, 혈전의 생성 등 생체 내에서 비교적 짧은 시간 내에 발생하며 조직을 전처리하기 어려운 다양한 생체 현상에 관한 정보를 얻는 데 이용할 수 있을 것으로 기대된다. 2차 근적외선 영역의 다중 영상화를 위한 형광 프로브 또한 개발하였다. 기존의 2차 근적외선 영역 발광체들은 데이터 후처리 없이 광학적 분리만으로 다중 영상을 구현할 수 있을 정도의 좁은 형광 분포를 확보하지 못했다. PbS/CdS 핵/껍질 구조의 양자점을 PbS 양자점의 양이온 교환 반응을 통해 합성하였으며, 핵 합성 및 양이온 교환 반응을 최적화하여 수용액 상에서 형광이 유지되면서도 형광 분포가 넓어지지 않는 최적의 합성 조건을 탐색하였다. 그 결과, 단층의 CdS 껍질을 갖는 PbS/CdS 핵/껍질 구조 양자점을 기반으로, 서로 다른 형광 파장(1080 nm, 1280 nm 최대값)을 가지며 좁은 형광 분포를 갖는 두 종류의 양자점을 확보하였다. 또한 개선된 고분자 캡슐화 방법을 통해, 합성된 양자점을 수용액 상에서 20 nm 이하의 충분히 작은 수화 크기와, 충분히 밝고 장기간 안정적인 형광 신호를 갖도록 분산시켰다. 생체 내 다중 영상의 응용 가능성을 확인하기 위해, 한 파장대의 캡슐화된 양자점 샘플을 엽산과 결합하여 암세포에 과발현되는 엽산 수용체를 특이적으로 표지하도록 하였으며 세포 실험을 통해 표적 능력을 검증하였다. 엽산을 결합한 캡슐화 양자점과 결합하지 않은 캡슐화 양자점은 비슷한 수화 크기 및 제타 전위를 가져, 엽산의 표적 능력을 제외하고는 비슷한 생체 내 분포 특성을 갖도록 설계되었다. 두 종류의 캡슐화 양자점 혼합물을 종양 이종 이식 마우스 모델에 정맥 내 주사하고 두 가지의 형광 채널에서 형광 신호를 분리하여 관찰하였다. 종양 조직 위치와 정상 조직 위치의 형광 신호를 두 종류의 채널에서 비교하여, 종양의 비특이적 축적 효과로부터 엽산의 특이적인 표적 능력의 효과를 분리하여 분석할 수 있었다. 개발된 2차 근적외선 다중 영상 프로브는 엽산 외에도 다양한 표적 인자들의 표적 능력을 검증하는 등 복잡한 생체 현상의 연구에 이용할 수 있을 것으로 기대된다.