RACK1을 이용한 C형 간염 바이러스의 간세포 내부 구조 변화에 대한 연구

Abstract

Hepatitis C virus (HCV) is a positive-strand RNA virus replicating in a membranous replication organelle composed primarily of double-membrane vesicles (DMVs) having morphological resemblance to autophagosomes. To define the mechanism of DMV formation and the possible link to autophagy, I conducted a yeast two-hybrid screening revealing 32 cellular proteins potentially interacting with HCV proteins. Among these was the Receptor for Activated Protein C Kinase 1 (RACK1), a scaffolding protein involved in many cellular processes, including autophagy. Depletion of RACK1 strongly inhibits HCV RNA replication without affecting HCV internal ribosome entry site (IRES) activity. RACK1 is required for the rewiring of subcellular membranous structures and for the induction of autophagy. RACK1 binds to HCV nonstructural protein 5A (NS5A), which induces DMV formation. NS5A interacts with ATG14L in a RACK1 dependent manner, and with the ATG14L-Beclin1-Vps34-Vps15 complex that is required for autophagosome formation. Both RACK1 and ATG14L are required for HCV DMV formation and viral RNA replication. These results indicate that NS5A participates in the formation of the HCV replication organelle through interactions with RACK1 and ATG14L.

C형 간염 바이러스 (Hepatitis C virus; HCV) 는 간경화와 간암을 유발하는 치명적인 바이러스로서, 현재 전 세계적으로 7천만명의 만성 감염환자가 있으며, 매년 35만명 이상이 이로 인해 목숨을 잃고 있다. 최근 개발된 신약들을 통해 많은 이들이 치료에 성공했지만, 높은 치료 비용과 백신의 부재, 치료한 사람에게 재감염 되는 등의 문제로 인해 HCV 박멸은 아직 가능하지 않은 실정이다. HCV는 사람의 간세포에 특이적으로 감염하는 바이러스로서, 숙주세포에 감염 시 RNA 유전체 복제를 위한 특이적인 막 구조를 형성한다. 기존 연구들에 따르면, 막 구조는 두 겹으로 싸여있는 형태를 띠고 있기에, 세포질과 같은 위치를 가짐과 동시에 숙주세포의 면역 작용을 피할 수 있다. 이 막 구조를 Double membrane vesicle (DMV) 라고 칭하며, 구조상으로 자식작용 (Autophagy) 이 일어날 때 만들어지는 세포내 막 구조와 유사성을 가지나, 구체적인 생성 기작은 알려진바 없다. 본 연구는 DMV 형성을 이해하고, 더 나아가 항 바이러스제 개발을 위해 진행되었다. DMV 생성 기작을 알기 위해, Yeast two-hybrid screening을 진행 하였고, 이를 통해 HCV 단백질들과 상호작용하는 32가지 단백질들을 찾아 내었다. 그 중, RACK1 (Receptor for Activated Protein C Kinase 1)이 NS5A 단백질과 결합하는 것을 확인하였다. RACK1 은 세포 내 여러 기작에 관여하며, 특히 Autophagy 에도 관여한다고 알려져 있다. HCV 감염 실험을 통해, RACK1 의 발현을 억제할 경우, HCV 의 증식이 크게 저해됨을 확인 하였다. RACK1 과 상호작용하는 NS5A는 HCV가 형성하는 DMV에 중추적인 역할을 하는 단백질로, 특히 NS5A의 Domain 1 이 필수적이다. Yeast two-hybrid assay를 통해, RACK1과 NS5A의 Domain 1이 직접적으로 상호작용한다는 사실을 확인 하였다. 다음으로 Autophagy와 NS5A, RACK1 간의 상관관계를 파악하는 실험을 하였고, 그 결과 NS5A의 Domain 1에 의해서 Autophagy가 활성화됨을 관찰할 수 있었다. 또한, 이러한 Autophagy 활성이 RACK1에 의존적으로 조절됨을 확인하였다. 어떻게 Autophagy가 활성화 되는지를 알아보기위해, Autophagy 기작의 초기 단계인 Vesicle Nucleation 에 초점을 맞추었다. 이 과정에 관여하는 Beclin1-ATG14L-Vps34-Vps15 단백질들과 NS5A가 상호작용함을 확인 하였고, 특히 ATG14L과 NS5A 와의 상호작용은 RACK1에 의해 조절되는 것을 볼 수 있었다. ATG14L의 발현을 저해하면 HCV의 증식이 억제되는 것으로 보아, HCV 감염 후, 유전체 복제를 하는데 있어 RACK1과 ATG14L이 중요한 역할을 한다고 결론을 내렸다. 최종적으로 전자현미경을 통해 RACK1과 ATG14L의 발현을 저해한 상황에서 HCV 가 형성하는 DMV 를 관찰하였고, 그 결과 DMV 개수가 두 상황에서 모두 현저히 감소함을 확인하였다. 본 연구를 통해서 HCV 증식에 필수적인 특이적 막 구조인 DMV가 형성되는 세포내 기작을 최초로 규명하였으며, RACK1과 ATG14L이 본 과정에 필수적임을 알 수 있었다. 본 연구를 통한 DMV 형성 기작에 대한 이해는, 향후 항 HCV 약 개발과 다른 RNA 바이러스의 연구 및 치료에도 큰 기여를 할 수 있을 것이라 기대한다.