단일 분자 수준에서 본 DNA 오류 염기쌍 제거 메커니즘

Abstract

생명체 근원에 대한 궁금증을 풀기 위해 생물학 분야에서는 다양한 앙상블 실험들이 이루어졌음에도 실험적 한계로 인하여 여전히 많은 의문점들이 남게 되었다. 이러한 실험적 한계를 극복하기 위하여 개별 생체 분자의 움직임을 실시간으로 관찰 할 수 있는 단 분자 생물물리 (Single-molecule Biophysics) 분야가 발전하였으며, 이로 인하여 단백질의 본질적인 이질성 (heterogeneity) 을 확인 할 수 있게 되었다. 이번 학위 논문에서는 Flow-stretching 기술과 이를 기반으로 전반사 현미경 (TIRFM) 과 결합한 Correlative smFS combined with TIRFM 기술을 개발하여 Escherichia coli의 앙상블 DNA 염기쌍 오류복구과정에서 DNA 가닥 제거에 관여하는 단백질들의 움직임을 관찰 하였다. DNA에 기록된 유전 정보를 온전하게 보존하기 위해서는 염기쌍에 오류가 있어서는 안 되기 때문에 염기 쌍 오류를 고치는 일은 매우 중요하다. 이에 따라 DNA 염기 쌍 오류 복구 과정 중 하나인 DNA 가닥 제거에 대하여 많은 연구들이 이루어져 왔다. 지금까지 Escherichia coli 시스템에서 DNA 가닥 제거는 MutH 단백질에 의해 새롭게 생성된 DNA의 hemimethylated GATC site에 DNA 간극 (nick) 이 만들어 지며, DNA 간극으로부터 나선효소 (helicase) 에 의해 DNA 풀림이 일어나고 핵산분해효소 (exonuclease) 에 의해 DNA 가닥 제거가 일어난다고 알려 져 있다. DNA 염기쌍 오류복구과정에 관여하는 나선효소 UvrD 는 약 50개 염기쌍 (base pair) 정도의 DNA를 풀 수 있다고 보고되어 있으며 염기 쌍 오류 복구 과정 전반에 관여하는 중심적인 단백질은 MutL의 도움을 받아 풀림 정도가 매우 증가하는 것으로 보고되었다. 하지만 우리의 사전 연구에 따르면 생리적인 조건과 유사한 고농도의 염분 농도에서는 단일 가닥과 이중 가닥 양쪽 모두에 MutL이 결합하지 못 한다. 그렇기 때문에 고농도의 염분 농도에서 어떻게 MutL이 UvrD의 DNA 풀림을 증가시키는가에 대한 연구를 진행하였으며, 이번 연구를 통해 MutS에 의해 MutL이 ATP 결합을 통해 슬라이딩 클램프 (sliding clamp) 형태를 이루었을 때 UvrD의 DNA 풀림을 약 400개 염기쌍으로 증가시키는 것을 확인하였다. 반면에 DNA 풀림 속도는 약 54 bp/s로 MutL이 없을 때와 유사하게 측정 되었다. 이를 통해 MutL sliding clamp에 의해 UvrD의 DNA 풀림 능력은 증가하지만 풀림 속도에는 영향을 주지 않는다는 것을 확인하였다. 또한 이번 연구를 통해 SSB에 의해 UvrD/MutL sliding clamp 복합체의 DNA 풀림 정도가 조절되며 최대 풀림 정도는 평균 1100개 염기쌍으로 측정되었다. 마지막으로 오류 염기쌍 제거에 관여하는 단백질이 모두 있을 때, 핵산분해효소 ExoI는 염분 농도가 증가함에 따라 핵산분해 활동이 감소하는 것을 관찰하였으며, 염분 농도가 증가함에 따라 45개의 뉴클레오타이드를 제거 할 수 있는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 다른 핵산분해효소 ExoVII와 RecJ에서도 비슷하게 관찰하였다. 이러한 결과에 비추어 볼 때, 이번 실험을 통해 기존에 알려 진 사실과는 다르게 핵산분해효소에 의해 DNA 제거는 거의 일어나지 않는 것을 확인하였다. 또한 Escherichia coli 시스템에서 인접한 hemimethylated GATC site 까지의 평균 거리는 227 베이스 페어로 측정되었다. 이러한 사실들에 비추어 볼 때, Escherichia coli 시스템에서 DNA 가닥 제거는 MutS에 의해 MutL이 ATP 결합을 하여 sliding clamp 형태를 이루게 되며 MutH에 의해 DNA 간극이 여러 곳에 생기게 된다. 이때 생긴 간극을 통해 UvrD가 결합하게 되며 MutL sliding clamp와 복합체를 이루어 DNA 풀림이 발생하며 인접한 간극 사이에 있는 단일 가닥을 모두 풀어 제거하는 방식으로 DNA 가닥 제거는 일어난다.

To solve the questions about the origin of life, various ensemble experiments have been carried out in the biology field. However, many questions still remain due to experimental limitations. To overcome these experimental limitations, the Single-molecule biophysics field, which allows real-time imaging of the movements of in-dividual biomolecules, has been developed, thereby confirming the inherent heter-ogeneity of proteins. In this thesis, Flow-stretching (FS) and Correlative FS combined with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) were developed to observe the movement of proteins involved in DNA strand excision in Escherichia coli (E.coli) DNA mismatch repair (MMR). MMR is very important to preserve genetic infor-mation recorded in DNA. Thus, many studies have been conducted on DNA strand excision, one of the DNA mismatch repair processes to remove the mismatch. Un-til now, DNA strand excision in E.coli has been known to be initiated from DNA nick in the hemimethylated GATC site, which is generated by MutH protein: UvrD helicase unwinds duplex DNA from the nick, and then an exonuclease excises a DNA strand. The helicase UvrD can unwind DNA of only ~50 base pairs (bp), but the degree of unwinding is greatly increased by the MutL in the core protein in-volved in the MMR. However, according to our previous studies, MutL does not bind to both single strand and duplex DNA at high salt concentrations similar to physiological conditions. Therefore, we investigated how MutL increases the UvrD unwinding processivity at high salt concentrations. This study showed that when MutL forms a sliding clamp through ATP binding by MutS, the UvrD unwinding processivity increases about 400 bp. On the other hand, the UvrD unwinding rate was about 54 bp/s, similar to in the absence of MutL. These results indicate that MutL sliding clamp increases the UvrD processivity but does not affect the unwind-ing rate. Interestingly, the unwinding and rezipping of a UvrD/MutL sliding clamp complex were controlled by single-strand binding protein (SSB) and the maximum amounts of unwound nucleotides (nt) was measured as 1.1 kilo-bp on average in the absence of exonucleases. Finally, we observed that the exonuclease I (ExoI) activity of nucleotides excision decreases with increasing salt concentration in the presence of MMR components, and nucleotides excision length by ExoI saturated to 45 nt. We obtained similar results for exonuclease VII and RecJ. As a results, this study has shown that DNA strand excision rarely occurs by the exonuclease, contrary to the known facts. Based on the results, we proposed that in E.coli, MutH recruited by MutS and MutL sliding clamps makes multiple nicks at the hemimethylated GATC site around the mismatch, a UvrD/MutL sliding clamp complex unwinds DNA between adja-cent nicks, and then the mismatch can be removed with the unwound single-stranded DNA.