A study on comparative genome analysis of small and large intestinal Lgr5+ stem cells

Abstract

Genome analysis is the identification, measurement or comparison of genomic features such as DNA sequence, gene expression or regulatory and functional element annotation at a genome scale. The intestinal epithelium is one of the best-defined adult stem cell models. It is the most rapidly self-renewing tissue in adult mammals. The high turnover rate of the intestinal lining is due to a dedicated population of Lgr5+ stem cell. However, the same Lgr5+ stem cells in the small intestine and the large intestine differentiate into different cell types depending on the organ specific function. In the small intestine, Lgr5+ stem cell produces the paneth cell and +4 stem cell and make the intestinal villus structure unlike colon. The large intestine only produces high-density goblet cells. Thus, my research focused on how Lgr5+ stem cells in the small intestine and large intestine produce the different types of cells at the transcriptome level. I downloaded and analyzed the public transcriptome data of small intestine and large intestine from human embryos between 6 and 25 weeks using single-cell RNA-seq analyses. As expected, the small and large intestinal stem cells are similar to each other at the early stage but they are separated at the late stage. Using single-cell trajectory reconstruction analysis, the branch point was identified such that Lgr5+ stem cells have organ specific characteristics, suggesting the transcriptomic dynamics during the bifurcation. Moreover, this study uncovered the heterogeneity of Lgr5+ stem cell during the fetal development. In summary, through scRNA-seq data analysis of small intestine and large intestine, I revealed the differences between small and large intestine Lgr5+ stem cells and transcriptomic dynamics during stem cell fate determinations. In addition, this study identified four distinct subpopulations of Lgr5+ stem cell during the fetal development and verified the marker genes of each subpopulation. These results may facilitate the identification of a specific regulator that determines the Lgr5+ stem cell fate.

성체 줄기세포는 분화가 끝난 신체 각 조직에 극히 소량으로 존재하는 미 분화된 세포로 죽은 세포나 손상된 조직을 대체하는 세포이다. 장 상피세포는 다른 세포들보다 빠른 회전율을 가지고 있어, 성체 줄기 세포 모델 중 가장 많이 연구된 모델이다. 장의 성체 줄기 세포는 Wnt signalling에 속하는 Lgr5유전자 발현을 통해 확인할 수 있다. Lgr5+ 줄기세포는 장 구조 중 움의 가장 아래 존재하며 자가분열을 하면서 장 세포로 분화하고 시간이 지나면서 세포들의 위치를 이동해 융모로 올라가 융모 끝에서 세포 사멸을 통해 사라지는 과정을 거친다. 그러나 소장과 대장에 위치한 동일한 Lgr5+ 줄기 세포는 위치한 장기 특이 적 기능에 따라 다른 세포 유형으로 분화된다. 소장에서는 Lgr5 + 줄기 세포가 paneth cell와 +4 줄기 세포를 생성하고 융모 구조를 형성한다. 대장은paneth과 +4 줄기세포는 생성하지 않고, goblet cell을 고밀도로 생성한다. 따라서 이 연구는 소장과 대장의 Lgr5+ 줄기 세포가 어떻게 다른 세포들을 생성하는지를 전사체 수준에서 조사하였다. 나는6 주에서 25 주 사이의 인간 배아에서 소장과 대장에서 추출된 단일 세포 전사체 데이터를 이용해서 배아 발달과정 중 소장과 대장이 어떻게 달라지는지를 연구하였다. 6주부터 25주 사이에 추출된 소장과 대장의 유사성을 확인했을 때, 초기 발달 단계에 있는 세포들은 소장과 대장 서로 유사하나, 후기 단계에서는 세포 타입에 따라 나뉘는 것을 확인하였다. 발달 과정 단계 중 어느 시점에서 Lgr5+ 줄기세포가 장기 특이적인 특성을 가지는지 확인하기 위해, 단세포 궤도 재구성 분석을 사용하여 분기점을 확인하였다. 그 결과, 3개의 분기점 중 마지막 분기점 에서 후기 세포들이 소장과 대장으로 나뉘는 것을 확인하였고, 3번째 분기점 에서 변화는 유전자들에 집중하였다. SI- branch에서는 영양소 분해와 흡수를 위해 필요한 효소를 적절한 타이밍에 생성하도록 조절하는데 중요한 enteric nervous system에 관련된 유전자들이 많이 발현하였으며, 영양소 분해 후 장에서 혈관으로 흡수하는데 사용되는 transmembrane transport에 관련된 유전자들이 많이 발현하였다. 또한 소장 특이적인 구조인 융모를 형성하는데 관여하는 유전자도 많이 발현하였다. LI-branch 에서는 immune system, muscle structure development에 관련된 유전자들이 많이 발현하였다. 3번째 분기점 이후로 각 branch에서 많이 발현하는 유전자들은 장기 특이적인 기능에 관련이 있었다. 추가적으로 이 연구는 태아 발달 과정 중 초기부터 후기까지 Lgr5+ 줄기세포의 이질성을 밝혔다. 초기 단계에 있는 세포는 소장과 대장이 유사하기 때문에 장기 특이적인 특징을 가지고 있지 않으며, “cell division”, “embryo implantation”, “Response to growth factor”, “endodermal cell differentiation” 와 같은 태아 발달에 관련된 유전자를 많이 발현하며, “Extracellular matrix organization” 에 속하는 유전자를 많이 발현함으로써, Lgr5+ 줄기세포의 줄기세포능을 유지시켜주는 niche를 형성한다. 중기 단계에서는 “Epithelial cell differentiation” 유전자를 많이 발현한다. 후기 단계에서는 소장과 대장의 Lgr5+ stem cell로 그룹이 명확히 나뉘어 지며, 각 그룹에 속하는 세포들은 앞서 밝혔던 branch 특이적인 유전자를 많이 발현하였다. 요약하면, 소장과 대장의 scRNA-seq 데이터 분석을 통해 소장과 대장 Lgr5 + 줄기 세포의 차이점을 찾았다. 또한, 본 연구는 태아 발달 과정에서 Lgr5 + 줄기 세포의 4 종류의 그룹으로 나눔으로써 이질성을 확인하였고, 각 그룹의 마커 유전자를 증명하였다. 이러한 결과를 바탕으로 소장과 대장의 Lgr5+ 줄기세포 차이를 더 싶게 연구함으로써, Lgr5+ 줄기세포의 cell fate를 결정하는 유전자를 찾을 수 있을 것이다