Flagellin-induced interferon-beta production and its role in anti-flagellin antibody responses

Abstract

플라젤린은 운동성 박테리아의 편모를 구성하는 주요 구조 단백질로서, TLR5와 NLRC4 염증조절복합체의 신호전달을 통해 선천성 면역반응을 유도한다. 또한 플라젤린은 항원성을 띠어 플라젤린 특이적 항체 반응 등의 후천성 면역반응 또한 유도한다. TLR5가 결손된 생쥐는 정상 생쥐에 비해 IgA 타입의 플라젤린 특이적 항체의 감소를 보이며, 장내 미생물의 불균형과 편모성 박테리아에 의한 점막 장벽의 손상 등으로 인해 만성 장염에 취약하다. 이러한 사실은 플라젤린 특이적 항체 반응이 장내 항상성 유지에 있어 중요한 역할을 함을 암시한다. 하지만 플라젤린 특이적 항체 반응의 조절 메커니즘은 아직까지 명확하게 알려져 있지 않다. 박테리아를 인식하는 여러 다른 톨라이크수용체들이 1형 인터페론 생산을 매개하며, 1형 인터페론이 IgA 생성을 조절할 수 있다는 것이 알려져 있다. 하지만, TLR5 활성화에 따른 1형 인터페론 유도에 대한 연구 결과는 기존에 보고된 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 우선 플라젤린이 TLR5 신호 전달을 통해 1형 인터페론을 생성하는지 알아보고자 하였다. 이에 다양한 in vitro와 in vivo 실험을 통해 플라젤린이 TLR5, MyD88, UNC93B1에 의존적으로 인터페론 베타를 생성함을 발견하였다. 또한 플라젤린은 TLR5 의존적으로 1형 인터페론 수용체를 활성화시켜 다양한 유전자의 발현을 촉진함을 확인하였다. 인터페론 베타를 생성하는 세포에서는 YFP 또한 발현되도록 만든 유전자 조작 생쥐(mob)를 이용하여 골수 유래 단핵구와 호중구, 그리고 비장의 대식 세포와 일부 수지상 세포 등의 면역세포가 플라젤린 자극에 의해 인터페론 베타를 생성함을 확인하였다. 이들 세포는 TLR5를 발현하는 것으로 이미 보고된 바 있다. 인터페론 조절 인자(IRF)는 톨라이크수용체의 신호 전달에 의한 1형 인터페론 생성에 관여하는 주요 전사 인자로 알려져 있는데, 본 연구에서는 플라젤린 자극이 IRF3와 IRF7의 인산화를 촉진하여 핵 내로의 이동을 유도함을 발견하였다. 또한 흥미롭게도 플라젤린에 의한 여러 다른 염증성 사이토카인의 생성과는 달리 1형 인터페론 생성을 위해서는 TLR5가 세포막으로부터 엔도라이소솜(endolysosome)으로 이동해야 함을 발견하였다. 이러한 결과는 TLR5가 세포막과 산성 환경을 지닌 엔도라이소솜에서 각기 다른 신호 전달 체계를 활성화함을 의미한다. 즉, 플라젤린은 세포 표면에 존재하는 TLR5에 결합하여 염증성사이토카인 생성을 위한 신호 전달을 유도하고, 이후 세포 내 엔도라이소솜으로 이동하여 인터페론 베타의 생성을 유도하는 것으로 추정된다. 1형 인터페론 수용체가 결손된 생쥐에 플라젤린을 복강 내 주사한 이후, 혈청과 대변 추출물의 항체양을 조사한 결과, IgG2c와 IgA 타입의 플라젤린 특이적 항체가 정상 생쥐에 비해 상당히 감소되어 있음을 발견하였다. 이 결과는 플라젤린 자극에 의해 생성되는 인터페론 베타가 플라젤린 특이적 항체의 클래스 전환(class switching)을 조절함을 알려준다. 이후 IgA 타입의 플라젤린 특이적 항체 생성의 조절 메커니즘을 밝히고자 여러 실험을 진행하였다. 하지만 플라젤린 자극에 의한 수지상 세포의 장간막 림프절로의 이동이나 이러한 이동에 중요하게 작용하는 케모카인 수용체인 CCR7의 발현 양상은 정상 생쥐와 1형 인터페론 수용체가 결손된 쥐에서 차이를 보이지 않았다. 또한 형질 세포 분화 실험을 통해, B 세포에서의 직접적 1형 인터페론 수용체 신호전달이 플라젤린 자극에 의한 IgA 형성에 관여하지 않음을 확인하였다. 따라서, 플라젤린에 의해 생성된 인터페론 베타가 플라젤린 특이적 항체 반응을 어떻게 조절하는지는 아직까지 명확하지 않으며 이에 대한 후속 연구가 진행되어야 한다. 결론적으로, 본 연구는 운동성 박테리아의 플라젤린이 TLR5/MyD88 경로를 통해 세포 내 엔도라이소솜에서 인터페론 베타 생성을 촉진하고, 1형 인터페론 신호 전달을 통해 IgG2c와 IgA 타입의 플라젤린 특이적인 항체 반응을 유도함을 규명하였다. 이 연구는 장 건강과 백신 개발을 위한 새로운 전략 수립 및 다양한 플라젤린 유도성 면역 활성 기전 연구에 기여할 것으로 기대한다.

Flagellin is a major structural protein of flagella present in motile bacteria and induces innate immune responses via signaling of TLR5 and the NLRC4 inflammasome. Antigenicity of flagellin also generates adaptive immune responses, including anti-flagellin antibody production. TLR5-deficient mice show the reduction in anti-flagellin IgA antibodies at steady state, intestinal dysbiosis, and mucosal barrier breach by flagellated bacteria to induce chronic intestinal inflammation. This suggests that anti-flagellin antibodies have an important role in maintaining intestinal homeostasis. However, regulatory mechanisms of flagellin-specific antibody responses remain unclear. Several bacterial ligand-sensing TLRs induce production of type I IFNs, and the IgA class switching can be regulated by the type I IFN signaling. Thus, I investigated whether flagellin induces the production of type I IFNs via TLR5 signaling. I found that flagellin induced production of IFN-β in a TLR5-, MyD88-, and UNC93B1-dependent manner in vitro and in vivo. Flagellin-induced type I IFN receptor signaling was also activated in a TLR5-dependent manner. By using the IFN-β-YFP reporter mice, I identified that several immune cell types in bone marrow and spleen produce IFN-β upon flagellin stimulation. Members of the IRF family are known to function as transcription factors for expression of the type I IFNs downstream of TLR signaling. I found that flagellin promoted phosphorylation and nuclear translocation of IRF3 and IRF7. Interestingly, internalization of TLR5 from the plasma membrane to acidic environment of endolysosomes was required for production of IFN-β, but not for other pro-inflammatory cytokines. This suggests that TLR5 activates the distinct signaling pathways for production of pro-inflammatory cytokines and IFN-β at the plasma membrane and in the endolysosome, respectively. I further found that anti-flagellin IgG2c and IgA, but not IgG1, responses were significantly reduced in the IFN-α receptor 1 (IFNAR1)-deficient mice compared to those in wild type littermate control mice. In contrast, anti-ovalbumin antibody responses were not defective in the IFNAR1-deficient mice, implying that the flagellin-stimulated IFN-β signaling specifically promotes the anti-flagellin IgG2c and IgA class switching. I also tried to understand how IFN-β regulates the anti-flagellin IgA responses and investigated whether the type I IFN receptor signaling regulates the migration of CD103+CD11b+ lamina propria dendritic cells to the mesenteric lymph nodes to promote the IgA response. However, flagellin-induced accumulation of intestinal dendritic cells in the mesenteric lymph nodes was not impaired in the IFNAR1-deficient mice. In addition, B cell-intrinsic type I IFN receptor signaling was not required for the flagellin-induced differentiation of IgA-secreting plasma cells in vitro. These results suggest that IFN-β regulates flagellin-specific IgA responses by mechanisms other than the dendritic cell migration and the B cell-intrinsic IFNAR1 signaling. In summary, I found that flagellin induces IFN-β production via the TLR5/MyD88-dependent signaling in endolysosomes and the type I IFN receptor signaling is required for anti-flagellin IgG2c and IgA responses. This study shed a new light on the regulation of flagellin-mediated immune activation and may help find new strategies to promote the intestinal health and develop mucosal vaccines.