Development of Fluorescent Nucleic Acid Systems Based on Repeat Sequences

Abstract

Ever since chemical modification of nucleic acids started fluorophore-modified oligonucleotides have become fascinating tool for novel fluorescent systems. They show unique photophysical and structural properties, which can be used to probe specific sequences, structures, and behaviors of nucleic acids. With the aim of developing new fluorescent nucleic acid systems, repeat sequences have been considered as good targets since they frequently appear in biologically important nucleic acid sequences and also exhibit unique structures and behavior in the specific condtions. In the present study, we demonstrate new fluorescent nucleic acid systems and their applications based on repeat sequence. We have developed several nucleic acid systems, including fluorescent probe for (i) GGG triad sequences, (ii) human telomeric DNA sequences, (GGGTTA)n, and (iii) CTG/CAG repeating sequences, and (iv) novel fluorescent DNA scaffold comprised of polydeoxyadenylate, (dA)n sequence. These nucleic acid systems are expected to provide valuable informations about properties of repeat sequences.

Chapter I. Detection of GGG triad sequences by using fluorescent probes containing DNSC

Under necessity for development of environmental sensitive fluorescent nucleoside, A novel nucleoside (DNSC), modified 2′-deoxycytidine bearing 5-(dimethylamino)naphthalene-1-sulfonyl (dansyl) at N4 position, has been synthesized and its properties are tested in monomeric and oligomeric states. The DNSC exhibits intramolecular photoinduced electron transfer between dansyl and cytosine resulting in remarkable fluorescence change depending on solvents. Fluorescence and thermal stability of oligonucleotides containing DNSC is susceptible to flanking and neighbouring bases. Especially, DNSC exhibits fluorescence enhancement only in fully matched duplex containing a GGG triad sequence. These environmental sensitivities of DNSC can be further used as fluorescence tool for monitoring interaction of DNA with biomolecules such as DNA, RNA, and proteins.

Chapter II. Development of a fluorescent probe for repeat sequence at the 3´-overhang of telomeric DNA

A 6-mer oligonucleotide containing a fluorescent BodU moiety forms a self-assembled tetramolecular G-quadruplex that undergoes fluorescence quenching in the presence of K+ and Na+ ions. This self-assembly process competes with the formation of a fluorescent (3+1) intermolecular G-quadruplex when oligonucleotides featuring three repeating GGG sequences [e.g., T(GGGTTA)3T] are added. Accordingly, this fluorescence system behaves as a probe for G-rich repeating sequences, especially for the 3´-overhang of telomeric DNA.

Chapter III. Quencher-free molecular beacons for selective and sensitive detection of CAG trinucleotide repeat sequence

We have identified quencher-free molecular beacons that allow the sensitive probing of CAG repeat oligonucleotides, including mRNA fragments of trinucleotide repeat diseases, with significant changes in fluorescence intensity mediated by disruption of the stacking of their PyU units.

Chapter IV. Development of PyA-modified fluorescent probes for CTG trinucleotide repeat sequence

A CAG-based probing system has been developed—taking advantage of the π-stacking of PyA units and the formation of exciplex signals—for the detection of CTG repeat sequences with dramatic changes in fluorescence visible to the naked eye.

Chapter V. Construction of PyA-modified Adenine Cluster systems based on unique properties of polydeoxyadenylate

In this study, we investigated the properties of novel fluorescent DNA scaffolds, PyA-modified adenine clusters (A-Clusters), based on the unique features of adenine units. The basic A-Cluster unit was an adenine-pentad duplex containing stacked PyA pairs in the center aligned in an antiparallel manner. Spectral analysis revealed remarkable reddish fluorescence with a large Stokes shift (195 nm), as well as significant sequence- and positional-dependency (adenine specificity) of the fluorescence, originating from the statically excited exciton state of the series of adenine bases. Structurally, the A-Cluster exhibited unusually high stability, relative to that of other five-mismatched duplexes, as a result of stabilization through strong stacking interactions of the mismatched A–A and PyA pairs, rather than through traditional Watson–Crick base pairing. Furthermore, in systems containing multiple A-Clusters, the spectral and structural properties of the A-Clusters were enhanced through synergistic effects. Thus, A-Clusters are promising scaffolds for fluorescent nucleic acid probing systems, nanostructures, and nanodevices.

Chapter VI. Disassembly of PyA-modified polydeoxyadenylate self-duplex by intercalative binding of coralyne to PyA

We report specific binding of coralyne to 3′ side of PyA in single-stranded PyA-modified polydeoxyadenylate, based on the π-π stacking interactions. This phenomenon leads to disassembly of PyA-modified polyadenylate self-duplex which can be useful properties for understanding behaviour of PyA-modified polyadenylate and for building stimuli-responsive nanostructure.

핵산의 화학적 변형이 이루어진 이래로, 다양한 형광체들로 표지된 올리고뉴클레오티드들은 생체 내 핵산의 염기서열과 구조 및 거동을 살펴보기 위한 형광 핵산 시스템들을 개발하는데 있어 유용하게 이용되었다. 그 중 반복 염기서열은 게놈의 많은 부분을 차지하여 생명 현상과 밀접한 관련을 가질 뿐만 아니라, 특정 조건에서 독특한 이차구조를 이룬다는 특성 때문에 형광 핵산 시스템의 적합한 표적 염기서열으로 여겨져 왔다. 따라서 본 연구에서는 이러한 반복 염기서열에 기반한 새로운 형광 핵산 시스템을 개발하고 이를 응용하고자 하였다. 결과적으로, 본 연구를 통해 GGG 삼염기 서열, 인간 텔로미어의 GGGTTA 반복 염기서열, CTG와 CAG 삼염기 반복서열을 탐지할 수 있는 형광 시스템을 개발하였으며, 연속된 아데닌 염기서열인 poly(dA)에 기반한 기존에 없었던 새로운 형광 발산 시스템을 구현하고 이에 대한 특성을 조사하였다. 위 개발된 형광 핵산 시스템 결과들은 반복 염기서열에 대한 귀중한 정보들을 제공할 수 있을 것으로 기대된다.

Chapter I. DNSC가 포함된 형광 뉴클레오티드를 이용한 GGG 삼염기서열의 직접적 감지 미세 환경에 민감한 형광 뉴클레오시드의 개발을 목표로 디옥시사이티딘의 N4 위치에 5-(dimethylamino)naphthalene-1-sulfonyl (dansyl)이 결합된 DNSC 를 합성하였다. DNSC는 dansyl과 사이토신간의 강한 전자적인 상호작용으로 인해 용매의 극성과 프로톤의 유무에 따라 큰 형광 변화를 보여주었다. 이렇듯 주변 환경에 대해 높은 민감도를 가지는 DNSC는 특정 삼염기서열에 따라 큰 형광 변화를 보여주었다. 특히 -CDNSCC- 를 포함한 올리고뉴클레오티드는 GGG 삼염기서열을 선택적으로 감지할 수 있었으며, 이는 C와 G 간의 상보적인 수소결합에 결과라고 생각된다. 이러한 독특한 특성에 기반하여 DNSC는 DNA 와 DNA, RNA, 단백질간의 상호작용을 살펴볼 수 있는 물질로써도 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Chapter II. G-quadruplex에 기반한 텔로미어 DNA의 3’-overhang 염기서열 형광 탐침의 개발 새로운 형광 뉴클레오시드인 BodU 를 합성하고 이를 짧은 6-mer 5’-BodUGGGTT 염기서열로 도입하였다. 이 뉴클레오티드는 K+ 나 Na+ 이온 존재하에서 사분자 G-quadruplex를 이루게 되고 그 결과로 BODIPY 형광체의 형광 소광이 일어난다. 반면 T(GGGTTA)3T 과 같이 G-quadruplex를 이룰 수 있는 반복 염기서열이 존재할 경우, 짧은 올리고뉴클레오티드는 사분자 G-quadruplex 구조가 아닌 (3+1) 분자간 G-quadruplex를 이루게된다. 이 경우, BODIPY 간의 자가 소광효과가 사라지게되어 큰 형광 발산을 보여주게 된다. 이러한 형광 핵산 시스템을 통하여 GGG 반복 염기서열 중 하나인 인간 텔로미어의 3’-overhang 부분을 선택적으로 탐지하는 시스템을 개발하였다.

Chapter III. 무소광체 형광 비컨을 이용한 CAG 삼염기 반복서열의 선택적, 효과적인 탐지 헌팅턴 병과 같은 유전 질병 중 일부는 mRNA내의 CAG 삼염기 반복서열이 비정상적으로 길어지게 되어 나타난다. 따라서 이런 삼염기 반복서열을 탐지하고 이들의 특성을 조사하는 것은 중요하다. 본 연구에서는 두개의 PyU를 CAG 반복 염기서열과 상보적인 CTG 반복 염기서열내에 도입하고, 6종의 무소광체 형광 비컨을 개발하였다. 이 무소광체 형광 비컨들은 CAG 반복 염기서열이 존재하지 않을 경우 머리핀 모양을 이루고 PyU간의 겹침 효과로 인해서 매우 큰 소광을 보여준다. 반면 CAG 반복 염기서열 존재하에서 무소광체 형광 비컨은 CAG 염기서열과 이중가닥을 이루게되고, 이에 따른 매우 큰 형광 증가를 보여주었다. 이러한 형광 증가는 DNA CAG 반복 염기서열 보다 RNA 반복 염기서열에 대해서 더욱 효과적임을 알 수 있었으며, CAG 반복 염기서열을 포함한 실제mRNA의 일부 염기서열 존재하에서도 큰 형광증가를 보여주었다. 이러한 결과는 개발된 무소광체 형광비컨이 CAG 삼염기 반복서열을 매우 효과적으로 탐지하기 위한 도구로 사용될 수 있다는 점을 시사하였다.

Chapter IV. PyA형광 뉴클레오시드를 이용한 CTG 삼염기 반복서열 형광 탐침의 개발 CAG 삼염기 반복서열과 마찬가지로 비정상적인CTG 삼염기 반복서열의 증가는 근긴장성이영양증과 같은 질병을 유발할 수 있다. 본 연구에서는 CTG 삼염기 반복서열을 감지하기 위한 탐침으로써, PyA 형광 뉴클레오시드를 이용하였다. 한쌍의 PyA가 올리고뉴클레오티드 상에서 서로 겹쳐질 경우 형광 발산의 파장이 푸른색 영역에서 초록색 영역으로 변화한다는 점을 이용하여, 두개의 PyA를 CAG 삼염기 반복서열의 대칭적인 위치에 도입하여 형광 탐침을 제작하였다. CTG 삼염기 반복 염기서열 유무에 따른 형광 탐침의 머리핀과 이중가닥 구조간의 구조변화를 형광으로 관찰할 수 있었다. 형광 파장의 변화에 기반한 위 형광 탐침은 CTG 삼염기 반복서열을 육안으로 탐지하는 것을 가능하게 하였다.

Chapter V. 폴리아데닐기의 특성에 기반한 PyA-modified A-cluster시스템의 개발 본 연구에서는 아데닌이 연속적으로 반복된 폴리아데닐기의 특성에 기반하여 독특한 형광과 구조적인 특성을 나타내는 PyA-modified A-cluster를 개발하였다. 기본A-Cluster구조는 중간에PyA 를 포함한5개의 연속된 두 아데닌 반복 염기서열이 역평행한 방향으로 만들어지는 이중가닥으로 이뤄진다. A-Cluster는 형광 핵산 시스템이 가져야할 요소 중 하나인 큰 스토크스 이동 (~195 nm)과 붉은 빛의 형광을 보여주었다. 또한 이 형광은 다수의 아데닌이 이루는 들뜬 익시톤 상태로부터 비롯함을 알 수 있었으며, 기존의 엑시머 (excimer)나 FRET 시스템에서 볼 수 없는 염기서열 내 높은 아데닌 의존성을 보여주었다. 구조적인 측면에서, A-Cluster는 5개의 아데닌-아데닌 미스매치를 가짐에도 불구하고 특이적인 구조 안정성을 보여주었으며 이는 기존의 Watson-Crick 염기쌍이 아닌 A-Cluster내 아데닌간의 스태킹 상호작용에 의한 것임을 알 수 있었다. 더 나아가, A-Cluster를 일정한 간격(1,4-관계)으로 나열했을 경우에, 그 특성이 증가되는 것을 확인하였다. 위와 같은 특성들을 통하여 A-Cluster는 새로운 형광 탐침 시스템이나 나노구조, 나노장치 분야에서 유망한 재료로 이용 될 수 있을 것으로 기대된다.

Chapter VI. Coralyne의 층간 삽입에 의한 PyA 변형 폴리아데닐기 자가 이중가닥의 분해 기존의 A-Cluster나 PyA 변형 폴리아데닐기가 염기간의 스태킹을 통하여 안정한 자가 이중가닥을 이룬다는 결과를 바탕으로, 이들과 층간 삽입 물질과의 상호작용에 대한 이해를 하고자 하였다. 층간 삽입 물질 중 coralyne은 폴리아데닐기의 아데닌 사이에 쉽게 층간 삽입되어 역평행한 폴리아데닐기 이중가닥을 이룰 수 있도록 해주는 물질이다. PyA 변형 폴리아데닐기의 특성을 coralyne의 유무에 따라서 조사한 결과, coralyne이 PyA 변형 폴리아데닐기 자가 이중가닥의 구조를 방해하여 단일 가닥으로 유도하는 동시에, 이 구조의 특징적인 붉은 빛의 형광을 감소시키는 것을 확인하였다. 이러한 효과는 coralyne이 파이렌을 포함한 PyA의 넓은 방향고리와 이의 3’방향의 아데닌 사이에 층간 삽입되어, 자가 이중가닥에서 존재하는 염기간의 스태킹 안정화를 방해하여 나타난 것임을 알 수 있었다. 본 결과는 외부의 물질을 통하여 PyA 변형 폴리아데닐기의 자가 이중가닥을 구조를 방해할 수 있다는 첫 번째 결과로써, DNA 나노구조와 형광 시스템 분야에서 PyA 변형 폴리아데닐기를 응용할 수 있는 기본적인 정보를 제공할 것이다.