Studies on the functional roles of EZH2 and SUZ12 protein in F9 murine embryonal carcinoma cell

Abstract

분화는 특정 유전자뿐 만 아니라 관련된 factor, 후성유전학적 메커니즘의 전체적인 조절에 의해 일어나는 매우 복잡한 현상이다. Embryo 가 분화하는 동안 PRC2(Polycomb repressive complex)는 H3K27me3 와 같은 발현을 억제하는 후성유전학적 변형을 일으켜서 유전자를 조절한다고 잘 알려져 있다. 본 연구에서는 분화 과정 중 PRC2 가 어떤 역할을 하는지 알아보기 위해, F9 murine embryonal carcinoma cells 에 CRISPR-Cas9 을 통해 PRC2 core component 를 KO 하여 유전자 발현 변화를 확인해보았다. 그 결과, EZH2-/- 와 SUZ12-/- 세포에서 proliferation 관련된 유전자와 oxidative phosphorylation 에 관련된 유전자가 감소한 것을 확인하였으며, 이는 PRC2 component 가 cancer metabolism 에 관여한다는 것을 보여준다. 또한 TGF-β- BMP signaling pathways 에 관련된 유전자가 증가하는 것을 확인하였다. 우선, 우리는 F9 cell 분화를 위해 세포에 retinoic acid 를 처리하였다. F9 cell 1day culture 후 1 μM retinoic acid 를 3 일 처리한 후 cell morphology 와 RT-PCR 을 통한 endodermal marker genes (SOX17, GATA4, GATA6, FOXA2) 의 발현을 확인함으로써 분화된 것을 확인하였다. Genome wide level 에서 확인하기 위해, 우리는 D0 와 D3 의 RNA-seq 과 Ezh2 antibody, H3K27me3 antibody ChIP-seq 데이터를 비교하였다. D0 에 비해 D3 에서는 endodermal marker gene 의 증가와 endodermal marker gene 의 promoter 와 gene body region 의 repressive mark H3K27me3 level 감소하는 것을 확인하였다. F9 의 분화 과정 중 Ezh2 와 Suz12 의 역할을 확인하기 위해, 우리는 CRISPR/Cas9 방법을 이용하여 Ezh2 와 Suz12 를 Knock out 시켰다. 이후 Ezh2 와 Suz12 의 영향을 global gene expression 에서 확인하기 위해 RNA- sequencing 을 진행한 후, D0 RNA-seq 데이터와 비교하였다. 54 차별 발현 분석을 통해 찾은 유전자 중, Ezh2 와 Suz12 KO sample 에서 D0 에 비해 증가하는 유전자들 Ezh2 의존적 영향을 보여주는 cluster 1 과 Suz12 의존적 영향을 보여주는 cluster2 와 PRC2 complex 영향을 보여주는 cluster 3 로 나눌 수 있다. 공통적으로 증가하는 유전자들은 cell differentiation 과 proliferation, development 에 관여되어 있는 것을 확인하였다. KO 에서 감소하는 유전자들은 Oxidative phosphorylation 과 ribosome 에 관여되어 있는 것을 확인하였다. 따라서, 우리의 결과는 EZH2 와 SUZ12 가 마우스 배아 암 세포에서 적절히 분화되고 세포의 운명을 결정할 필요가 있음을 보여준다.

Differentiation is the most complex process, the result of rhythmic coordination between gene structure, other factors influence gene expression and epigenetic mechanisms. During embryo development, Polycomb repressive complex 2 (PRC2) is well known to regulate gene expression program by representing epigenetic repressive marks H3K27me3. To understand the role of PRC2 during differentiation, F9 murine embryonal carcinoma cells were used as a model system, under treatment of Retinoic acid (RA) for 3 days, cells were differentiated to primitive endoderm. I have used CRISPR-Cas9 system to completely knock-out PRC2 core component and performed whole transcriptome profiling (RNA-Seq). Functional analysis in Differentially Expressed Genes (DEG) was made between undifferentiated, differentiated and knockout cells to unveil functional roles of EZH2 and SUZ12 in term of gene expression control. Remarkably, no significant changes were observed in the 1 morphology of EZH2-/- and SUZ12-/- cells, but proliferation rate was dramatically decreased as compared with wild-type cells. A surprising number of oxidative phosphorylation genes was down-regulated upon knock out of PRC2 core components suggests promising feature of PRC2 in terms of cancer metabolism. Many genes in terms of TGF-β- BMP signaling pathways were up- regulated may answer the cell fate decision defect in knock out cells. This research has added an additional layer of understanding on the mechanism of PRC2 during differentiation and created a valuable platform for further discovery.