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Regulation of intracellular trafficking of Toll-like receptor 5

Title
Regulation of intracellular trafficking of Toll-like receptor 5
Authors
허지원
Date Issued
2017
Publisher
포항공과대학교
Abstract
Subcellular distribution of Toll-like receptors (TLRs) is strictly regulated for specific ligand recognition and adequate immune responses. While the TLRs sensing bacterial membrane components are expressed on the plasma membrane, the nucleotide-sensing TLRs, including TLR3, 7, 8, 9, and 13, are selectively sequestered in the endolysosomes where they signal in a low pH-dependent manner. Trafficking of the nucleotide-sensing TLRs from the endoplasmic reticulum (ER) to the endolysosomes fully depends on UNC93B1, and their signaling is completely abolished in the ‘triple defects’ (3d) mice bearing a missense mutation of UNC93B1. On the contrary, the signaling via TLR1, TLR2, TLR4, and TLR6 is unaffected in the 3d mice, therefore UNC93B1 was believed to have no role for the cell surface-localized TLRs. Unexpectedly, I found that TLR5, a cell surface sensor for bacterial protein flagellin, also requires UNC93B1 for plasma membrane localization and signaling. TLR5 physically associates with UNC93B1 via the transmembrane domain and the juxtamembrane acid residues. The cells from 3d or UNC93B1-deficient mice not only lack TLR5 at the cell surface but also fail to secrete cytokines and to up-regulate costimulatory molecules upon flagellin stimulation, demonstrating the essential role of UNC93B1 in TLR5 signaling. A recent study revealed that DNA-sensing TLR9 traffics to the plasma membrane first and is immediately and constitutively internalized through an UNC93B-mediated recruitment of the clathrin adaptor complex AP-2. I observed that the TLR5-UNC93B1 complex remains on the plasma membrane at steady state. Yet, it was unclear how TLR5 and TLR9 are differentially sorted at the cell surface. Here, I show that the cytosolic domain of TLR9 is dispensable for the constitutive internalization and that the carboxyl terminal region of TLR5 contains a cell surface retention motif. Deletion of the last 20 amino acids from TLR5 induced spontaneous receptor internalization whereas attachment of the same residues to the cytosolic end of TLR9 led to surface accumulation of the receptor. Furthermore, multiple lysine within the last 20 amino acid residues of the TLR5 cytosolic tail seem to inhibit the constitutive receptor endocytosis via electrostatic interaction. This study suggests a highly customized mechanism for the ER exit and plasma membrane retention of TLR5.
Toll-like receptor (이하 TLR)는 대표적인 선천성 면역 수용체로서 병원균에서 보존되어있는 특정 분자구조 (Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs) 또는 감염이나 특정 위험 상황에서 숙주 세포가 발현하는 분자구조 (Danger-associated molecular patterns, DAMPs)를 인지하여 빠르게 면역반응을 일으켜 병원균 제거와 조직 재생을 유도한다. 면역 반응 과정의 효율을 증가시킴과 동시에 자가 유래 물질에 대한 불필요한 면역반응을 최소화하기 위해 세포는 TLR을 최적의 세포내 소기관에 발현시키는 방법을 사용한다. 박테리아의 세포막 구성성분을 인식하는 TLR들은 주로 세포 표면에 발현되어 박테리아의 접근을 최대한 빠르게 인지하는 반면, 핵산 리간드를 인지하는 TLR들은 주로 면역 세포 내 엔도리소좀 (endolysosomes)에 특이적으로 발현된다. 이러한 선택적 운송과정은 UNC93B1 단백질에 의해 매개되며, UNC93B1의 비기능성 H412R 돌연변이형을 발현하는 3d 생쥐에서는 핵산 인지 TLR의 엔도리소좀으로의 운송이 일어나지 못한다. 그 결과 세포 표면에 발현되는 TLR1, TLR2, TLR4, TLR6의 리간드에 의한 면역 활성은 차이가 없는 반면 핵산 리간드에 의한 엔도리소좀 TLR의 면역 활성은 완전히 저해된다. 놀랍게도 본 연구에서는 세포 표면에 발현되며 박테리아 플라젤린 (flagellin) 단백질을 인식하는 TLR5의 면역 활성이 다른 표면 발현 TLR과는 다르게 UNC93B1에 의존적이라는 사실을 발견하였다. TLR5는 엔도리소좀 TLR과 유사하게 transmembrane domain 근처에 존재하는 다수의 산성 아미노산 잔기를 통해 UNC93B1과 결합하며, UNC93B1이 존재하지 않거나 기능에 문제가 있을 경우 소포체를 빠져나가지 못하므로 플라젤린에 대한 세포의 면역 반응성이 상실되는 것을 확인할 수 있었다. 최근, 엔도리소좀으로 운송되어 DNA에 대한 면역반응을 일으키는 TLR9의 경우, UNC93B1을 통해 소포체를 빠져나온 후 우선적으로 세포 표면으로 운송되지만, 보통 UNC93B1에 의한 AP-2 결합을 통해 신속하게 내재화 (internalization)되어 최종적으로 엔도리소좀으로 운송된다는 사실이 보고되었다. 본 연구실에서는 TLR5와 UNC93B1이 소포체를 이후에도 서로 결합을 유지한 채 세포 표면에 존재하는 것을 관찰한 바 있다. 이를 TLR9의 세포 표면 운송 현상과 함께 고려하였을 때, TLR5와 TLR9은 동일한 UNC93B1 단백질에 의해 소포체를 탈출하여 세포 표면에 도달하지만 TLR5는 세포 표면에 머무는 반면 TLR9은 선택적으로 신속한 내재화가 진행된다는 것을 의미한다. 본 연구의 두 번째 부문에서는 이러한 TLR 특이적 운송 조절 기전에 초점을 맞추었으며, 다양한 돌연변이 클로닝을 통해 TLR9의 세포질 영역 (cytosolic domain)은 세포 내 운송과정에 관여하지 않는 반면, TLR5의 카르복실 말단 20여개 아미노산 잔기에 세포 표면잔류를 유도하는 모티프가 존재하는 것을 발견하였다. 이들 20여 아미노산 잔기를 TLR9의 말단에 추가하였을 경우 TLR9 또한 TLR5처럼 세포 표면에 잔류하는 것을 관찰하였으며, 특히 20여 아미노산 잔기 중 다수의 염기성 잔기가 존재하며 이들 염기성 잔기가 가진 양전하에 의한 정전기적 상호작용이 TLR5의 세포 표면 발현을 조절함을 발견하였다. 본 연구는 최초로 TLR5의 세포 표면 운송에 대한 UNC93B1의 역할을 규명하였고 다른 UNC93B1-의존적 TLR들과는 차별화된 TLR5의 세포 표면 발현 기전을 발견함으로써, 단일 TLR에 특화된 운송 메커니즘과 이를 통한 특이적인 면역 조절 가능성을 제시하였다.
URI
http://postech.dcollection.net/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000002331394
http://oasis.postech.ac.kr/handle/2014.oak/93151
Article Type
Thesis
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