Two-Photon Microscopy for the Lower Gastrointestinal Tract

Abstract

Two-photon microscopy (TPM) is a nonlinear fluorescence microscopic technique widely applied for various biological studies including neurobiology, cancer biology, and immunology since it provides three-dimensional (3D) cellular information within tissue based on endogenous and exogenous fluorophores. However, the lower gastrointestinal (GI) tract imaging still has been limited because of the location of the GI tissues which are deeply located inside the abdominal cavity. Also, these tissues are morpho-functionally complicated and sensitive tissue for maintaining immune homeostasis that makes the limitation of imaging. Moreover, the lower GI tract has numerous cells and tremendous amount of microorganism including bacteria and fungi, thus, it makes difficulty in controlling and assessing them for the longitudinal in vivo studies. Most previous studies for the lower GI tract imaging provided its superficial information by using transgenic mice or exogenous fluorescence markers in relatively short time window. Although autofluorescence (AF)-based imaging without using the fluorescence labeling could visualize all the cells within the tissue, it can be visualized either by having a sufficiently high excitation laser power or by having a slow imaging speed due to the weak AF level. Furthermore, TPM-based 3D cellular and structural information of GI tract have not been well elucidated in live condition. Hence, it is necessary to develop effective imaging method and tools for in vivo longitudinal studies of GI tract at cellular-level under expanded time window. In this study, the aim is to develop a novel two-photon (TP) imaging method which overcomes several limitations of AF-based imaging and side-viewing rotational endomicroscopic imaging probe system for longitudinal studies of the lower GI tract with an outstanding image contrast at cellular-level, in vivo. First, I described the applications of moxifloxacin, an FDA-approved fluoroquinolone antibiotic, as a biocompatible cell-labeling agent for TPM to overcome the weak endogenous fluorescence in tissue and cytotoxicity of exogenous probes. By using TPM with moxifloxacin, various cell lines, and animal tissues including the lower GI tissues were imaged, analyzed and compared with endogenous fluorescence with second harmonic generation (SHG) signal within them. In addition, Paneth cells (PCs), key mediators for intestinal homeostasis by secreting antimicrobial factors, were studied in the intact mouse small intestine by TPM with moxifloxacin, in vivo. Finally, side-viewing rotational TP endomicroscopic system was developed and improved to study the lower GI tract, especially mouse colon, in vivo. In conclusion, this dissertation suggests novel TP imaging method using moxifloxacin and side-viewing rotational endomicroscopic imaging probe system for longitudinal studies of the lower GI tissues at cellular-level, in vivo. In addition, TPM application to the lower GI tissues using moxifloxacin labeling could contribute to study the microenvironment of another internal organ via TP endomicroscopy.

이광자현미경 (two-photon microscopy, TPM) 기술은 3차원 해상도를 갖는 형광 현미경 기술로서 세포 및 생체조직의 구조적인 정보를 제공할 수 있기 때문에 생물학, 생명공학 및 기초의학 연구 등에서 다양하게 사용되고 있다. 최근에는 이광자현미경 기술을 기반으로 한 뇌조직 내 신경구조 관찰, 조직 내 암 발생/형성과정 또는 세포 거동에 대한 실시간 관찰 등에 대한 세포 수준으로의 연구 결과들이 주목을 받고 있다. 최근에는 소화기 기관 내 면역체계 및 기능 연구를 위해서도 이광자현미경 기술이 이용되고 있다. 그러나 소장조직 및 대장조직과 같은 하부 소화기 기관에 대한 영상화 및 이광자현미경 기술을 기반으로 하는 연구는 소화기 기관 조직의 특성 때문에 살아있는 상태에서 장시간동안 영상화하는데 제약이 많아 어려움이 따른다. 왜냐하면, 하부 소화기 기관은 복부 안쪽에 깊이 위치하고 있을 뿐만 아니라 수많은 세포들은 물론 박테리아 (bacteria), 균종 (fungus)과 같은 수많은 미생물들이 공생하고 있으며 소화, 흡수 및 면역체계의 유지 등을 위해서 기능적으로 민감하고 구조적으로 매우 복잡한 조직이기 때문이다. 따라서 하부 소화기 기관에 대한 연구들은 주로 복잡하고 어려운 과정들을 통해 수행되어 왔으며 이광자현미경 기술 기반 연구들은 주로 조직 표면의 일부에 대해 비교적 짧은 시간 (~ 최대 8시간) 내에서 관찰된 정보만을 제공하고 있다. 따라서 하부 소화기 기관에 대한 생명학, 면역학, 암 발생학 등의 유의미한 기초연구를 위해서는 조직이 살아있는 상태에서 세포 수준의 정보를 제공하며 조직에 대한 장기간의 관찰과 분석이 가능한 이광자현미경 영상화 기술의 연구 및 개발이 필요하다. 본 연구에서는, 하부 소화기 기관에 대한 이광자현미경 영상화 기술의 연구 및 개발을 다루고 있다. 본 논문에서는 이광자현미경 영상화 기술에 대해서, 본 연구에서 제안한 목시플록사신 (moxifloxacin)의 조직 내 세포 염색제로의 활용을 검증하였고 조직 내 세포 영상화에 대한 획기적인 성능향상을 보였으며 인체 내 세포 관찰의 가능성까지 제시하였다. 한편, 목시플록사신을 이용한 이광자현미경 영상화를 통해 하부 소화기 기관 중 하나인 소장조직에 대해서 점막 면역 및 항상성 유지에 핵심적인 역할을 하는 파네스 세포 (Paneth cell)를 살아있는 마우스에서 영상화하는 방법을 개발하였다. 본 연구에서 개발한 생체 내 소장조직의 파네스 세포에 대한 영상화 기술은 향후 파네스 세포의 기능뿐만 아니라 관련 질병연구, 면역연구 등에도 응용될 수 있다. 나아가 하부 소화기 기관 중 하나인 대장조직에 대한 생체 내 영상화 및 장기간의 연구를 위하여 굴절률 분포형 (gradient index, GRIN) 렌즈를 기반으로 하는 소형 이광자 내시현미경 (endomicroscopy) 프로브 시스템을 개발하였다. 그리고 이광자 내시현미경의 영상을 향상하기 위해서 내시경 프로브로 사용된 GRIN 렌즈의 수차문제를 개선하였으며 이를 통해 살아있는 마우스의 생체 내 대장조직을 표피 (epithelium)부터 소낭선 (gland; crypt) 구조까지 내시경적인 방법을 통해 처음으로 영상화하는데 성공하였다. 본 연구에서 개발한 GRIN 렌즈 기반의 이광자 내시현미경 프로브 시스템은 향후 대장조직의 구조 관찰뿐만 아니라 대장조직 관련 질병모델의 장기적인 관찰 및 기초연구에 활용될 수 있을 것이다. 본 논문에서 다루고 있는 각 하위연구들에 대한 내용은 다음의 요약에 간략히 기술되어 있다. 결론적으로, 본 연구에서는 하부 소화기 기관에 대한 이광자현미경 연구의 영상화 기술과 새로운 시스템 개발 내용을 다루고 있으며 하부 소화기 기관에 대한 생체 내 영상화 및 연구가 가능하다는 것을 검증하였다. 나아가 본 연구에서 개발한 기술 및 시스템이 하부 소화기 기관뿐만 아니라 다른 조직들의 생체 내 연구에도 응용될 것으로 전망하며 이광자현미경 영상기술에 대한 임상으로의 활용가능성을 제시한다는 점에서도 기여하였다고 볼 수 있다.