Genome-wide study of cancer specific DNA double strand breaks and their epigenetic profile using gastric cancer cell lines

Abstract

내부적 혹은 외부적 요소로 인해서 게놈에는 계속적으로 순간순간 여러 가지 종류의 손상이 발생한다. DNA 이중가닥 손상 (DNA Double strand break)은 그 중 가장 유해한 데미지 중의 하나이며, 암에서 흔히 발견되는 유전자 서열 전좌(Translocation) 또는 서열 삭제(Deletion)의 원인이 된다. 비상동말단연결 (Non-homologous end joining)은 DNA 이중가닥 손상을 복구시키는 가장 중요한 기작으로써, DNA 양끝을 상동 서열의 템플릿이 없는 상태로 붙여서 DNA의 손상을 회복 시킨다. 그러나 이러한 현상에서 흔히 DNA의 돌연변이가 만들어 지고, 이 돌연변이들이 암에서 가지는 관련성은 끊임없이 대두되어 왔다. 그러나 암에서의 게놈 안정성, DNA 손상 반응, 그리고 이중가닥 손상의 발생 정도에 대한 지식은 많이 알려진 것이 없다. 이전 연구에서는 위암세포에서 발생하는 DSB가 NHEJ를 통해 복구될 수 있는 DSB site들을 인간의 전체 게놈 상에서 확인하기 위해 KATOIII, SNU484 두 개의 위암세포를 통해 Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq.)을 수행 하였다. 그래서 NHEJ 경로에서 중요한 역할을 하는 Ku70/80, DNA-PKcs, XRCC4, γH2AX를 인식하는 4가지 항체를 가지고 ChIP을 수행해서 DNA 단편들을 차세대 염기서열 분석 기술 (Next-generation Sequencing Technology)를 통해 분서하였다. 동일 선상에서 이번 연구에서는 추가로 정상 세포주인 HFE145에서 똑같이 ChIP-seq을 수행하고, 세가지 세포주의 데이터를 분석함으로써 187개의 암 특이적 DSB hotspot들을 동정하였으며, 그렇게 얻어진 후보 유전자들의 암 특이적인 특성과 후성유전적 패턴을 알기 위한 실험들을 수행하였다. 먼저 p53 단백질이 망가진 위암 세포주인 KATOIII와 SNU484의 게놈 안정성과 데미지 반응 능력을 확인하기 위해 웨스턴 블롯을 수행하였다. 두 가지 위암 세포주에서 모두 p53의 하위 단백질인 p21의 발현이 적은 것을 확인 하였고, 특히 KATOIII에서는 세포주기 조절과 DNA 손상복구와 관련이 있는 pRB의 발현이 현저히 줄어든 것을 확인 하였다. 각 세포주에서 히스톤 단백질을 추출해서 DNA 데미지 마커인 γH2AX의 발현 정도를 측정했을 때, KATOIII에서 가장 높은 DNA 데미지의 축적이 확인되었다. 이것은 게놈 안정성을 위해 p53을 비롯한 p21과 pRB단백질의 매우 중요하며, KATOIII 위암 세포주와 같이 이러한 단백질이 역할을 못할 때 DNA 데미지의 축적이 발생한다는 것을 증명해 준다. ChIP-seq. 실험을 통해 얻은 후보 유전자들이 암 특이성을 가지는 지 확인하기 위해서 6개의 유전자 (CDC27, SCML1, PID1, HFM1, PDE3A, CATSPER3)에서 NHEJ 관련 단백질의 발견 정도를 ChIP-qPCR 실험을 통해서 확인 하였다. HFM1을 제외한 모든 유전자에서 정상세포인 HFE145에서보다 암세포인 KATOIII와 SNU484에서 높은 Enrichment가 확인 되었으며, 본 연구에서는 이들을 Cancer specific DSB hotspot이라고 명명하였다. 다음으로, 발견된 암 특이적 DSB hotspot들의 후성 유전적 패턴을 알아보기 위해서, BS-seq을 통해 메틸화 정도를, 히스톤 변형 특이적 항체를 이용한 ChIP 실험을 통해 히스톤 변형 정도를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. BS-seq 실험 결과를 통해서 정상세포는 DSB sites에서 과메틸화가 발견되는 반면, 암세포에서는 저메틸화의 패턴이 발견되는 것을 확인 하였다. 메틸화 정도는 크로마틴의 구조를 변화시켜서 전사를 조절하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이번 실험을 통해서 저메틸화가 크로마틴의 풀린 구조를 만들고, 풀려진 크로마틴에서 DNA 이중가닥 손상이 더 높은 확률로 일어날 수 있다는 가능성을 보여 주었다. 또한 히스톤 변형을 조사하였을 때 H3K36me3 라는 히스톤 변형이 DSB site에 높게 발견되는 것을 발견 하였다. 웨스턴 블롯 결과에서 정상세포인 HFE145에 DNA 데미지 유발 약물을 처리하였을 때 H3K36me3의 발현이 증가하는 것을 확인 하였고, ChIP-qPCR 결과에서 정상세포 보다 위암 세포에서 H3K36me3 변형 정도가 DSB site에서 높게 관찰 되는 것을 확인 하였다. H3K36me3는 전사가 활발한 유전자의 gene body에서 많이 관찰되는 것이 알려진 만큼, DSB가 많이 일어나는 부위에서 이 특정 히스톤 변형이 저메틸화와 함께 크로마틴의 풀린 구조를 만들어 내서 DNA 이중가닥 손상에 연관이 될 수 있다는 가능성을 확인하였다. 본 연구에서는 이전과 다른 접근 방법을 이용해서 암 특이적 DNA 이중가닥 손상의 게놈 상에서의 분포와 위암세포의 게놈 안정성을 조사하는 새로운 방법론을 제시하였다. 더 나아가 본 연구에서 밝혀진 암 특이적 DSB 유전자들의 후보군들이 암 진단 marker로서의 적용 가능성을 보여 주었다. 마지막으로 DNA 이중가닥손상에 관련하는 새로운 후성유전적 마커를 발굴 함을 통해 향후 암에서의 게놈 안정성 연구에서 본 연구의 결과가 활용 될 수 있을 것이라 기대한다.

Instantaneous damage in genome continuously occurs in a cell as a result of intrinsic and extrinsic factors. DNA double strand break (DSB) is the most detrimental form of DNA damage, and a cause of deletions and translocations in the DNA that are commonly found in cancer. Non-homologous end joining (NHEJ) is a major pathway used to repair DNA lesions by rejoining two ends through direct ligation without the need of a homologous template. Because of its unique mechanism, NHEJ pathway frequently accompanies various types of DNA mutation, and its profound connection with cancer has been a field of interest for many cancer biologists. However, little is known about the genome stability of cancer as to ① how its damage response differs from the healthy counterpart, ② which has greater amount of DSB incidence between a cancer and a normal cell, and ③ what are the “cancer-specific” sites on the genome that are more vulnerable to DNA DSBs. In this research, I have used two gastric cancer cell lines, KATOIII and SNU484, and a normal gastric cell line, HFE145, as a model system to tackle such questions. Using chromatin immunoprecipitation followed by high-throughput sequencing (ChIP-seq), 187 sites of cancer specific DNA DSB hotspots are identified by analyzing genome-wide distribution of three NHEJ-associated DNA repair proteins, DNA-PKcs, Ku70/80, and XRCC4. Six genes (CDC27, SCML1, PID1, HFM1, PDE3A, CATSPER3) are selected for validation from promoter and gene body regions, where DSB incidence may have a critical influence on transcription. In addition, several experiments have been conducted to examine the genome stability of gastric cancer cell lines in comparison to its normal counterpart, to examine colocalization of the core NHEJ repair proteins in the nucleus, and finally to characterize the epigenetic status over the cancer specific DSB hotspots. Notably, DNA methylation, more so than histone modification, seems to be a highly influential factor, as it is known to be closely related with chromatin remodeling. The result overall holds implication for therapeutic and diagnostic application for gastric cancer by means of preventing the incidence of DSBs and manipulating the epigenetic status on the cancer specific DSB hotspots.