Construction of a Platform Escherichi coli Strain for the Production of Lycopene

Abstract

Isoprenoids are one of the natural product groups that have been considered as attractive molecules owing to the beneficial effects on human health as pharmaceuticals or nutraceuticals, such as anticancer reagents, vitamins and antioxidants. In nature, many microbes synthesize the common precursors of various isoprenoids, IPP and DMAPP, through the MVA or the MEP pathway. Previously, many attempts to redesign the MEP pathway in E. coli for increasing pool of the key intermediates, IPP and DMAPP, have been tried but these attempts were totally not successful. The lack of successes in engineering the MEP pathway led to the awareness that the MVA pathway is efficient to produce isoprenoid. But, the final titers of the desired products would become economically feasible when the MEP pathway is rationally designed, built, and optimized by synthetic biology tools because MEP pathway has theoretically efficient carbon yield than MVA pathway - the MEP pathway consumes 1 glucose for 1 IPP, whereas the MVA pathway does 1.5 glucose. Here, I demonstrated the lycopene production as model product via the MEP pathway in E. coli. The native MEP pathway and heterologous lycopene producing pathway were reconstituted based on synthetic biology approach through synthetic expression cassette, such as synthetic promoter, terminator, and synthetic 5’-UTR, to allow for channeling carbon fluxes toward lycopene. Specifically, heterologous lycopene pathway, crtE, crtB, and crtI, were introduced and amplified with synthetic constitutive strong promoter (BBa_J23100), terminator (BBa_B1005), and synthetic 5’UTR designed to maximize the expression levels of each enzymes in E. coli. The resulting strain, JYJ0 expressing crtEBI, produced 0.38 mg lycopene/g dcw of lycopene. Likewise, debottlenecking of the native MEP pathway (dxs, idi, ispA), resulted in 4.0 mg lycopene/g dcw. The strain, JYJ3, increased 10-fold lycopene production by amplifying three bottlenecks. The engineered strains in this study would be the platform strain to produce other a variety of isoprenoids.

이소프레노이드는 자연계에 존재하는 가장 다양한 탄화수소 화합물 군이다. 최근, 이 물질들이 가지는 의약품, 건강증진기능식품, 항암물질 등의 효능이 밝혀지며 주목을 받고 있다. 라이코펜은 많은 식물과 미생물들이 만들어내는 이소프레노이드 중 한 물질로 항산화제, 항암물질, 항염증제 등의 기능을 하며 현재 의약품이나 기능보조제, 화장품 첨가물로서 다양하게 사용된다. 라이코펜은 주로 토마토에서 추출하거나 화학적 합성을 통해 생산되었으나, 일정하지 않은 수확량과 낮은 생산량 때문에 증가하는 라이코펜 수요에 대해 충분한 공급이 어려운 실정이다. 최근 미생물의 유전자 조작을 통해 원하는 물질을 생산하는 방법에 대한 연구가 활발히 진행되고 있고 이러한 연구들의 생산과정에서의 성공적인 적용으로 수요가 많은 다양한 화학물질들의 부족한 공급량을 보충하고 있다. 따라서 라이코펜 뿐만 아니라 다양한 고 가치 이소프레노이드를 지속적으로 많이 생산하기 위해서는 다양한 이소프레노이드의 공통 전구체인 IPP와 DMAPP를 많이 생산할 수 있는 미생물이 필요하다. 많은 미생물에서IPP와 DMAPP는MEP 생합성 대사경로와 MVA 생합성 대사경로를 이용하여 합성된다. MVA 생합성경로는 MEP 생합성경로보다 더 먼저 밝혀져 이에 대한 많은 연구들이 이미 선행되었고 많은 정보가 알려져 있기 때문에 효율적으로 IPP와 DMAPP를 만든다고 널리 알려져 있다. 그러나 이론적으로 MEP 생합성경로가 MVA 생합성 경로보다 더 적은 탄소와 산화환원 반응을 이용하여 이소프레노이드 전구체를 생산한다. 따라서 적절한 유전자 조작을 통해 최대 효율을 가지는 MEP 생합성경로를 지니는 균주를 개발하게 된다면 MVA 생합성 경로를 이용하는 것 보다 더 적은 탄소로 많은 이소프레노이드를 만들어 낼 수 있게 될 것이다. 최근까지 대장균에서 MEP 생합성 대사경로를 최적화하여 라이코펜 생산을 증가시킨 연구들이 있었다. 하지만 이전 연구들은 주로 프로모터 치환을 통한 전사단계에서의 발현량 조절이나 조합적 접근법에 기초하여 라이코펜 생산에 영향을 미치는 유전자들의 발현량 조절에만 국한되어 있다. 하지만mRNA 상의 5’-UTR 서열이 형성하는 1차 및 2차 구조가 번역효율을 결정지을 수 있기 때문에 MEP 생합성 대사경로를 최적화 시키기 위해서는 번역효율을 정교하게 조절할 수 있는 도구가 필요하다. 최근 우리 연구실에서 개발한 UTR designer는 목적 유전자의 5’-UTR 서열을 통해 발현량을 예측할 수 있고, 또한 원하는 발현량을 갖도록5’-UTR 서열을 디자인할 수 있는 도구이기 때문에 MEP 생합성 대사경로의 효소들의 발현량을 최대화 하는 본 연구에 유용한 도구로 사용되었다. 본 연구에서MEP 생합성 대사경로를 최적화하기 위해서 UTR designer와 같은 합성생물학적 도구들을 이용하여 라이코펜 대사경로상의 효소들의 발현량을 최대한 증대시켰다. 우선, 라이코펜을 생산하기 위해서 필요한 heterologous 유전자인 crtE,B,I 가 항시 발현하는 synthetic promoter와 높은 발현량을 가지도록 디자인된 5’-UTR 에 의해 과발현 되도록 유전자 카세트를 설계하였고, 더불어 대장균에서의 번역 효율을 높이기 위하여 codon optimization을 수행하였다. 또한 이전 연구들에서 밝혀진 MEP 생합성 대사경로상에서 과발현이 필요한 유전자인 dxs, idi, ispA의 발현량을 crtE,B,I 를 과발현 시킨 것과 같은 방법으로 최대한 증대시켰다. 이런 방식은 목적 유전자를 과발현 시킴과 동시에 대장균 내에서의 아직 밝혀지지 않은 유전자 발현 조절 메커니즘을 회피할 수 있게 한다. 그 결과, MEP 대사경로를 최적화시킨 대장균 strain은 crtE,B,I 만 과발현 시킨 균주보다 약 10배 증가된 라이코펜 생산량을 보였다. 본 연구에서 개발한 균주는 추후의 연구들에서 라이코펜 뿐만이 아니라 다른 고가치 이소프레노이드의 생산에 사용될 플랫폼 균주로서 사용될 수 있을 것이다.