CLOCK 단백질의 새로운 조절 인자들에 대한 연구

Abstract

일주기 리듬은 24시간을 주기로 하며 체내 생리작용과 행동을 조절하는 생물학적 리듬이다. 분자수준에서 일주기 리듬은 분자시계 (molecular clock)에 의해 조절이 되는데, 이는 유전자의 전사와 단백질 번역 후 조절 단계에서 양성 피드백 고리 (positive feedback loop)과 음성 피드백 (negative feedback loop)로 구성된다. 분자시계는 세포 내에서 내재적으로 일어나며 분자시계의 작동은 양성 피드백 고리의 핵심 전사 조절인자인 CLOCK단백질과 BMAL1단백질의 활성화로부터 시작이 된다. CLOCK 단백질과 BMAL1단백질은 세포질에서 이형복합체를 형성함으로써 핵 내로 이동한 후, 자신들의 basic helix-loop-helix 도메인을 통해 유전자의 프로모터에 존재하는 E-box 를 인식하여 Per, Cry 유전자와 같은 음성 피드백 고리의 핵심 요소들의 주기적인 발현을 유도한다. CLOCK/BMAL1 이형복합체에 의해 새로 생성된 PER단백질과 CRY단백질은 세포질에서 이형복합체를 형성, 다시 핵 내로 이동한 뒤 CLOCK/BMAL1 이형복합체의 전사활성 기능을 억제한다. 이 과정에서 분자시계의 정밀한 작동과 극적인 활성화를 위해 또 다른 중요한 조절기전이 필요한데, 이는 분자시계의 핵심 요소들에게 영향을 주는 단백질의 번역 후 조절 단계로서 글리코겐 합성 효소 인산화 효소 (GSK3β) 및 카제인 인산화 효소 (CKIε/δ)등이 알려져 있다. 그러나, 현재까지 여러 조절 기전들이 보고 되고 있음에도 불구하고, 분자시계의 피드백 고리의 역동적인 기전에 대해서는 알려진 바가 많지 않다.사이클린 의존성 인산화 효소 5 (Cdk5)는 프롤린 지향성 세린-트레오닌 인산화 효소로서 신경계에 특이적으로 발현 되는 활성인자인 p35와 p39에 의해 활성도가 조절 된다. Cdk5는 다양한 신경계 작용에 기능을 가지며 대뇌 보상시스템과 향정신성물질을 비롯한 다양한 약물들의 작용을 매개하는 것으로 알려져 있다. 또한 Cdk5의 활성화가 다양한 정신질환 및 관련 상태의 유발에도 작용을 가지는 것으로 보고되어 있다. 이번 연구에서, 나는 Cdk5가 분자시계의 CLOCK 단백질을 조절하는 새로운 인자로서의 기능을 가질 수 있음 제시한다. Cdk5는 CLOCK 단백질의 트레오닌 451번과 461번 아미노산을 인산화 시킴으로써 CLOCK 단백질의 전사활성화 기능을 조절할 수 있다. 이러한 Cdk5에 의한 CLOCK의 기능적 조절은 CLOCK단백질의 안정성과 세포 내 분포의 변화에 의해 매개된다. 이러한 결과들을 토대로 Cdk5가 CLOCK단백질을 조절함으로써 분자시계에 영향을 줄 수 있는 새로운 조절 인자가 될 수 있음을 생각해 볼 수 있다.더욱이, 나는 CLOCK 단백질이 DISC1단백질과 기능적으로 연관이 있음을 발견하였다. DISC1 유전자는 조현병 유발 인자로 각광을 받고 있는데, 이는 1번 염색체와 11번 염색체간의 전좌로 인해 DISC1 유전자가 손상이 되어 카복시 말단이 잘려진 형태의 DISC1단백질이 생성되고, 이 손상된 단백질이 비정상적인 뇌의 발달과 주요정신 질환의 발병에 관여 되어 있기 때문이다. 이번 연구에서 나는 CLOCK단백질이 DISC1 단백질의 카복시 말단을 통해 상호작용을 가짐을 밝혔다. 또한, CLOCK단백질의 과발현이 DISC1단백질의 세포핵 내 축적에 영향을 미치는 한편 카복시 말단이 절단된 DISC1 단백질은 이러한 현상이 보이지 않음을 발견하였다. 반대로 CLOCK 단백질의 발현 억제는 핵 내 DISC1 단백질의 양을 감소시킴을 발견하였다. 핵 내 DISC1 단백질은 핵 내에 존재하는 CLOCK과도 효율적으로 co-localization이 됨을 보였는데, 이는 핵 내의 DISC1 단백질이 CLOCK 단백질의 기능에 영향을 미칠 가능성이 있음을 시사한다. 실제로, 분자시계가 동기화 된 세포에서 DISC1 단백질의 발현 억제는 CLOCK 단백질의 표적 유전자인 mPer1 유전자의 mRNA의 비정상적인 발현을 일으켰고 DISC1 단백질이 mPer1 유전자의 프로모터의 E-box에 결합될 수 있음을 확인하였다. 뿐만 아니라, CLOCK 단백질의 전사활성을 억제하는 PER1 단백질이 DISC1 단백질과 복합체를 형성할 수 있음을 밟힘으로써 DISC1 단백질이 CLOCK 단백질에 의한 전사활성에 영향을 미칠 수 있는 가능성을 발견하였다. 종합적으로 이러한 결과들은 DISC1 단백질이 CLOCK 단백질과 기능적으로 연관되어 있으며 CLOCK 단백질의 전사활성화 기능에 영향을 줄 수 있음을 제시한다.요약하자면, 나는 CLOCK 단백질을 조절함으로써 분자시계에 작용을 나타내는 새로운 조절 인자로서 Cdk5와 DISC1 단백질을 발견하였다. 임상적 관점에서 일주기 리듬과 정신질환의 관련성은 오래 전부터 제기되어 왔으나, 명확한 분자적 기전은 아직까지 밝혀지지 않은 상태이다. Cdk5와 DISC1 단백질이 다양한 정신질환적 상태와 관련이 있다는 점을 고려하면, 이번 연구는 일주기 리듬과 다양한 정신질환과의 관련성에 대한 분자적 연결고리를 제시할 것으로 기대한다.

Circadian rhythm is a biological rhythm governing physiology and behavior with a period of approximately 24 hours. At the molecular level, circadian output is controlled by a molecular clock composed of positive and negative feedback loops in transcriptional and post-translational processes. This cell-autonomous event is initiated by a positive limb of feedback loops comprised of CLOCK and BMAL1, the core components of a positive limb. CLOCK and BMAL1 forms heterodimer, and this complex enters the nucleus and binds to E-box elements through their basic helix-loop-helix domain, drive the rhythmic transcription of clock-controlled genes including Per and Cry, the core components of a negative limb. Newly synthesized PER/CRY proteins undergo heterodimerization and translocation to the nucleus, then, they repress the transcriptional activity of CLOCK/BMAL1 complex. Importantly, these core molecular clock components require regulatory components including glycogen synthase kinase 3β (GSK3β) or Casein Kinase I ε/δ (CKI ε/δ) for fine-tuning and robust activation of molecular clock. Although several regulatory processes have been reported, the intrinsic dynamics of the molecular clock feedback loops is yet poorly understood.Cyclin-dependent kinase 5 (Cdk5) is a proline-directed serine-threonine kinase that is controlled by the neural specific activators, p35 and p39. Cdk5 controls various neuronal processes and acts as a modulator of the brain reward system, mediating the response to various drugs including psychostimulants. Moreover, several reports suggest that Cdk5 activities in the brain are linked to various psychiatric diseases related conditions. In this study, I provide evidence showing that Cdk5 is a novel regulator of CLOCK protein. Cdk5 phosphorylates CLOCK at the Thr451 and Thr461 residues in association with transcriptional activation of CLOCK. The Cdk5-dependent regulation of CLOCK function is mediated by alterations of its stability and subcellular distribution. These results suggest that Cdk5 is a novel regulatory component of the core molecular clock machinery.Furthermore, I found that CLOCK is functionally connected with the Disrupted-in-schizophrenia 1 (DISC1). The DISC1 gene has emerged as a schizophrenia-susceptibility gene

translocation between chromosomes 1 and 11 ((1

11)(q42.1

q14.3)) directly disrupts DISC1 gene thereby expressing a truncated form of DISC1, which is related with abnormal brain development and pathogenesis of major mental illness. In this study, I provide evidence showing that CLOCK interacts with DISC1 via C-terminal region of DISC1. Moreover, overexpression of CLOCK affects nuclear accumulation of DISC1, while the C-terminal region truncation of DISC1 abolishes its effect. Conversely, knockdown of endogenous CLOCK elicits a decrement of the nuclear DISC1 level. Nuclear DISC1 shows significant co-localization with nuclear CLOCK, supporting the potential role for DISC1 in the regulation of transcriptional function of CLOCK. Indeed, the knockdown of DISC1 causes abnormally enhanced mPer1 mRNA expression at the inhibitory phase in synchronized cells. Moreover, DISC1 effectively binds to E-box elements of mPer1 promoter region, where CLOCK binds for transcriptional activation of mPer1 gene. Complex formation of DISC1 with PER1 further supports the notion that nuclear DISC1 may act as a repressor of CLOCK-dependent transcription. Collectively, these results suggest that DISC1 is functionally associated with CLOCK thereby affecting transcriptional regulation of molecular clock system.In summary, I identified Cdk5 and DISC1 as novel CLOCK protein regulatory components affecting molecular clock system. From the clinical point of view, relationship between circadian rhythm and psychiatric disease has long been postulated, while molecular mechanisms underlying this link are still largely unknown. As Cdk5 and DISC1 have been linked to various psychiatric conditions, the results of this study may provide mechanistic bridges between the circadian system and multiple psychiatric disorders.