Open Access System for Information Sharing

Login Library

 

Thesis
Cited 0 time in webofscience Cited 0 time in scopus
Metadata Downloads

표면 플라즈몬 형광 분광법을 이용한 DNA-DNA 상호 작용 연구 및 원자힘 현미경을 이용한 DNA 칩 분석

Title
표면 플라즈몬 형광 분광법을 이용한 DNA-DNA 상호 작용 연구 및 원자힘 현미경을 이용한 DNA 칩 분석
Authors
권성홍
Date Issued
2010
Publisher
포항공과대학교
Abstract
표면에 생분자를 고정화하는 것은 마이크로어레이, 바이오센서, 흡착 크로마토그래피, 효소면역측정법 같은 다양한 응용 분야에 적용되는 핵심 기술이다. 특히, DNA 마이크로어레이의 개발 이후 고정화된 생분자의 여러 특성에 관한 관심이 점점 높아지고 있다. 그러나 대부분의 생분자들 경우, 제한된 2차원의 공간에서는 수용액 상태에서의 고유한 활성이나 기능을 유지하지 못한다. 특히 DNA 마이크로어레이 연구에서는 표면에 부착된 탐침 DNA들 사이의 정전기적 반발력이나 입체적 장애로 인해 수용액 상태와 다른 양상을 보일 수도 있다. 이미 우리 그룹에서는 덴드론을 이용하여 탐침 DNA들 사이의 공간을 조절한 표면에서 단일염기변이 검출 능력 등, DNA 마이크로어레이의 성능이 향상된다는 결과를 발표하였다. 따라서 덴드론으로 개질된 표면에서 DNA 혼성화 양상에 대한 심도 깊은 연구를 위해 표면 플라즈몬 형광 분광법으로 속도상수와 결합평형상수를 구했다. 우선 졸-젤 기술을 이용하여 실리카 박막을 금 표면 위에 코팅한 후, 2세대 덴드론을 공유결합으로 고정화하고 탐침 DNA를 덴드론 말단에 결합시켰다. 덴드론으로 개질된 표면에서 DNA 혼성화 속도는 스트렙타비딘 (streptavidin)으로 개질된 표면에 비해 빠른 것으로 밝혀졌다. 뿐만 아니라 덴드론으로 개질된 표면에서 탐침 DNA는 대기 상태에서 장시간 노출되어도 표적 DNA와 혼성화하는 활성을 그대로 유지하였다. 이처럼 DNA 마이크로어레이에서 좋은 성능을 보이는 덴드론 표면을 원자 힘 현미경을 이용한 DNA간 상호 작용력과 특정 조직에서 mRNA의 분포에 관한 연구에 적용한 결과, 단일 생체분자간 상호작용 연구에 덴드론 표면이 적합하다는 것을 입증하였다. 따라서 우리는 DNA 마이크로어레이와 AFM을 이용한 접착 힘 지도화 (adhesion force mapping) 기술을 조합하여 적은 수의 표적 DNA를 검출할 수 있는 새로운 접근 방법을 개발하였고, 간단한 모델 시스템뿐만 아니라 만성 골수성 백혈병 환자 샘플 진단에도 적용시켰다. 특히, 접착 힘 지도화 분석법은 만성 골수성 백혈병 진단에 가장 많이 이용되고 정밀한 실시간 중합효소 연쇄 반응 (real-time PCR) 분석법으로 검출되지 않은 환자 샘플에서 BCR-ABL 융합 유전자를 검출할 수 있었다. 또한, 탐침 DNA에 혼성화된 단일 표적 DNA의 수력역학적 (hydrodynamic) 양상을 나노 수준의 고해상도 지도화를 통해 관측할 수 있었고, 측정된 수력역학적 거리가 이전에 발표된 연구 결과를 통해 계산된 값과 일치하는 것을 확인하였다. 극소량의 표적 DNA를 검출할 수 있는 접착 힘 지도화 기술은 일반적인 DNA 검출법이 갖는 검출한계 문제, 표적 DNA의 형광 표지화, 신호 증폭 및 PCR 과정에서 발생할 수 있는 오차 등의 한계점을 극복할 수 있을 뿐 아니라 만성골수성 백혈병 등 유전자 변형에 따른 질병의 조기진단과 약물 치료 중단 시기 결정에 도움을 줄 것으로 예상된다. 다양한 DNA 검출 기술 DNA는 알려 진 모든 유기체의 성장과 다양한 기능에 필요한 유전 정보를 담고 있는 핵산이다. 유전 정보는 전사 (transcription)와 번역 (translation) 과정을 통해서 전달된다. DNA는 상보적으로 특정 염기 서열간에만 결합을 하고 안정적이기 때문에 DNA 검출에 관한 많은 연구가 진행되었고, 질량, 전기화학적, 광학적, 기계적 성질 변화 등을 측정하는 다양한 기술들이 개발되었다. 비록 이런 기술들이 각각의 고유한 장점들을 가지고 있지만 여전히 극소수의 DNA를 검출하는 목표를 달성하기 위해서는 해결 해야 할 문제점들이 남아 있다. 한 예로, 가장 적은 수의 DNA를 검출할 수 있는 기술로 알려진 실시간 중합효소 연쇄 반응 분석법조차도 형광 표지의 사용, 중합효소 억제제의 존재, 증폭 실패, DNA 크기 제한 및 사용자에 따른 오차 등, 해결해야 할 제약점들이 있다. 따라서 사전 증폭, 표적 DNA 표지, DNA 크기 제한 등의 제약 없이 적은 수의 DNA를 검출할 수 있는 새로운 기술이 각종 유전병이나 전염병 진단을 위해 필요하게 되었다. 표면 플라즈몬 형광 분광법을 이용한 덴드론으로 개질된 졸-젤 실리카 박막에서 DNA-DNA 상호 작용 연구 이전에 마이크로어레이 연구에서 덴드론으로 개질된 표면이 좋은 단일 염기 변이 검출 능력을 보였고, 덴드론 말단에 고정화된 바이오틴이 스트렙타비딘과 더 잘 결합한다는 결과가 보고되었다. 따라서, 탐침 DNA의 공간이 조절된 덴드론 표면에서 혼성화 양상을 표면 플라즈몬 형광 분광법을 이용하여 심도 있게 연구하였다. 우선, 졸-젤 기술을 이용하여 실리카 박막을 금 표면 위에 코팅한 후, 2세대 덴드론을 공유결합으로 고정화하고 탐침 DNA를 덴드론 말단에 결합시켰다. 이때, 약 33 nm의 두께의 무기 삽입층 (inorganic interlayer)은 형광 감쇄를 효과적으로 막아 주었다. 덴드론으로 개질된 표면에서 DNA 혼성화 속도는 단일염기변이가 존재하는 경우의 해리 속도를 제외하고는 스트렙타비딘 (streptavidin)으로 개질된 표면에 비해 빠른 것으로 밝혀졌다. 뿐만 아니라 덴드론으로 개질된 표면에서 탐침 DNA는 대기 상태에서 장시간 노출되어도 표적 DNA와 혼성화하는 활성을 그대로 유지하였다. 원자힘 현미경을 이용한 DNA 칩 분석 DNA 마이크로어레이는 DNA 서열, 유전자 변형 및 유전자 발현 등을 고성능으로 여러 유전자를 동시에 검출할 수 있기 때문에 많은 관심을 받아 왔다. 그러나 일반적인 마이크로어레이는 유연성과 속도, 비용 및 검출 한계 등의 제약점을 가진다. 따라서 본 연구자는 DNA 마이크로어레이와 원자힘 현미경을 이용한 접착 힘 지도화 기술을 조합한 새로운 접근 방식을 통해 마이크로어레이 탐침 DNA 점 (spot)에서 표적 DNA를 검출하는 연구를 진행하였다. 이런 접근 방식은 탐침 DNA 점의 크기를 줄임에 따라, 극소수의 표적 DNA를 검출할 수 있었고 단순한 모델 시스템뿐만 아니라 만성골수성 백혈병 환자 샘플에까지 적용될 수 있었다. 또한, 탐침 DNA에 혼성화된 단일 표적 DNA의 수력역학적 (hydrodynamic) 양상을 나노 수준의 고해상도 지도화를 통해 관측할 수 있었고, 측정된 수력역학적 거리가 이전에 보고된 결과를 통해 계산된 값과 일치하는 것을 확인하였다. 검출 DNA와 표적 DNA 사이의 힘은 27 ÷ 3 pN이였고, 특징적으로 AFM 팁이 접근했다가 들릴 때, 검출 DNA와 표적 DNA의 혼성화가 풀리기 전에 힘-거리 곡선에서 늘어나는 부분이 관측되었다. 이는 혼성화에 참여하지 않은 표적 DNA의 일부분이 늘어나면서 생기는 현상으로 AFM 팁이 접근하는 위치에 따라 늘어나는 정도가 달라졌다. 극소량의 표적 DNA를 검출할 수 있는 접착 힘 지도화 기술은 일반적인 DNA 검출법이 갖는 검출한계 문제, 표적 DNA의 형광 표지화, 신호 증폭 및 PCR 과정에서 발생할 수 있는 오차 등의 한계점을 극복할 수 있을 뿐 아니라 만성골수성 백혈병 등 유전자 변형에 따른 질병의 조기진단과 약물 치료 중단 시기 결정 등에 도움을 줄 것으로 예상된다.
Immobilization of biomolecules on surfaces is an essential component for a variety of applications such as microarrays, biosensors, affinity chromatography, ELISA, etc. Particularly, since the introduction of DNA microarrays, the interest in immobilized biomolecules and their behavior has steeply increased. Most biomolecules seem to lose all or a part of their inherent activities and functions in the bulk aqueous phase when confined to a two-dimensional interfacial layer. In case of DNA microarrays, mainly electrostatic perturbation and a steric hindrance experienced by the immobilized DNAs may cause this distortion. We previously reported that performances of DNA microarrays, including SNP (or Single Nucleotide Polymorphism) discrimination efficiency, could be enhanced with the surface control by dendron. In order to confirm the kinetics and affinity characteristics of DNA hybridization on the dendron-functionalized substrate, surface plasmon field-enhanced fluorescence spectroscopy (SPFS) study was accomplished. A silica film was coated onto a gold substrate using the sol-gel technique, followed by the covalent immobilization of a layer of second generation dendrons with a DNA catcher strand at their apex. The kinetic rate constants found for DNA hybridization on the dendron-modified surface were larger than those reported for a streptavidin-modified surface by one order of magnitude, except for dissociation rate constant for a single mismatched case. In addition, we observed that the DNA on the cone-shaped linker maintained its capability to capture DNA target strands even after extended storage at ambient conditions. The dendron-functionalized surface was also applied to force-based atomic force microscope (AFM) to study DNA-DNA interaction and mRNA mapping on the sectioned tissue. These previously reported results showed the suitability of dendron-functionalized surface at the researches of single biomolecular interaction due to the lateral spacing control of immobilized biomolecules. We developed the novel approach combining DNA microarray and adhesion force mapping using force-based AFM to detect a low copy number of target DNA. The adhesion force mapping was applied to detect chronic myeloid leukemia (CML) samples as well as simple model systems. Especially, adhesion force mapping could sense BCR-ABL fusion c-DNA of a CML clinical sample not to detect by real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis. Also, the nanoscale maps indicated the hydrodynamic behavior of the captured single target DNA. The hydrodynamic distance of captured single DNA well coincided with the calculation value from previously reported data. This approach will help early diagnosis, the determination of time to terminate the treatment with medication and overcoming the limitations of common detection technologies such as low sensitivity, target DNA labeling with a fluorophore, target or signal amplification, and PCR error. Chapter I. Various Technologies for the DNA Detection Deoxyribonucleic acid (DNA) is a nucleic acid that contains the genetic information used in the development and function of all known living organisms. Transmission of genetic information is accomplished via transcription and translation process. DNA is well appropriate for bio-sensing applications, because the base-pairing interactions between complementary sequences are both specific and robust. So far, the research on DNA detection has been enormously carried out and a variety of technologies to monitor the change of mass, electrochemical, optical and mechanical property, etc, have also greatly been developed. Although each technology has its own advantages, it still remains several challenges for achieving a goal to detect extremely small copies of DNAs. For example, real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) well known for the most sensitive technology to detect DNA also has quite a few limitations such as the use of fluorescent dye, the presence of polymerase inhibitor, amplification failure, DNA size restraint and human error. Therefore, the necessity of the novel technology to detect DNAs of a small copy number without any pre-amplification, target DNA labeling with a fluorophore and the DNA size constraint is keenly needed for upgraded clinical diagnostics of genetic and infectious diseases. Chapter II. DNA-DNA Interaction on Dendron-Functionalized Sol-Gel Silica Films Followed with Surface Plasmon Fluorescence Spectroscopy Since we observed that dendron-assembled surface provided high single nucleotide polymorphism discrimination efficiency for DNA microarrays, and that the binding yield for streptavidin increased when biotin was immobilized on top of it, the nanoscale-controlled surface is examined for surface plasmon field-enhanced fluorescence spectroscopy (SPFS). Firstly, a silica film was coated onto a gold substrate using the sol-gel technique, followed by the covalent immobilization of a layer of second-generation dendrons with a DNA catcher strand at their apex. The thickness of the inorganic interlayer (d ≒ 33 nm) was effectively suppressing fluorescence quenching. Thus, the kinetics and affinity characteristics of DNA hybridization could be investigated very sensitively by SPFS. The kinetic rate constants found for DNA hybridization on the dendron-modified surface were larger than those reported for a streptavidin-modified surface by one order of magnitude, except for dissociation rate constant for a single mismatched case. In addition, we observed that the DNA on the cone-shaped linker maintained its capability to capture DNA target strands even after extended storage at ambient conditions. Chapter III. Force-Based Atomic Force Microscope as an Analyzing Tool for DNA DNA microarrays have attracted a great deal of attention because of high-throughput and/or highly parallel analysis of the DNA sequence, genetic variations, and gene expression. However, conventional microarrays have several limitations such as flexibility, speed, cost, and sensitivity. The novel approach combining DNA microarray and adhesion force mapping using force-based AFM was studied to understand its capability, in particular, sensitivity to detect target DNAs captured at a microarrayed spot. The adhesion force mapping was applied to chronic myeloid leukemia (CML) samples of a low copy number of c-DNA as the size of probe DNA spot was decreased to micron diameter level. Also, the nanoscale maps indicated the hydrodynamic behavior of the captured single target DNA. The hydrodynamic distance of captured single DNA well coincided with the calculation value from previously reported data. The mean value of specific force between detection DNA and target DNA was 27 ÷ 3 pN by Gaussian fitting in histogram curves. Especially, prior to the detection?Ctarget DNA rupture, flexible parts, including the DNA parts that do not participate in the hybridization event, were stretched during the retraction mode. The stretching distance was varied dependent on the position where AFM probe approached. This approach will help an early diagnosis, the determination of time to terminate the treatment with medication and overcoming the limitations of common detection technologies such as low sensitivity, target DNA labeling with a fluorophore, target or signal amplification, and PCR error.
URI
http://postech.dcollection.net/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000782596
http://oasis.postech.ac.kr/handle/2014.oak/809
Article Type
Thesis
Files in This Item:
There are no files associated with this item.

qr_code

  • mendeley

Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.

Views & Downloads

Browse