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양귀비과 식물의 현탁배양으로부터 몰핀 생산을 위한 알칼로이드 생합성 경로 연구

Title
양귀비과 식물의 현탁배양으로부터 몰핀 생산을 위한 알칼로이드 생합성 경로 연구
Authors
이홍순
Date Issued
2010
Publisher
포항공과대학교
Abstract
다양한 생물학적 활성을 갖는 benzylisoquinoline alkaloids (BIAs)을 생산하는 양귀비과 식물인 Papaver somniferum은 몰핀(morphine), 코데인(codeine) 등을 포함하는 몰핀계 알칼로이드의 주요 생산원으로, 이 식물의 미성숙 삭(果, capsule)의 유액(latex)에서 알칼로이드를 추출한다. P. somniferum의 미분화 세포 현탁배양은 in vitro에서 알칼로이드를 생산하는 생물반응기(bioreactor)로서 연구되어 왔으나, sanguinarine, chelirubin 등 benzophenanthridine alkaloids (BPAs)가 주로 생산될 뿐, 몰핀계 알칼로이드는 생산되지 않는 것으로 보고되고 있다. 이는 조직 분화가 일어나지 않는 미분화 세포 시스템의 한계로 여겨지므로 본 연구에서는 P. somniferum의 현탁배양에서 이차대사 과정을 이해하고, 대사공학을 통해 미분화 세포에서의 몰핀 생산을 도모하고자 하였다. 식물 조직 및 세포 배양에서 유도물질(elicitor) 처리는 다양한 신호 전달 체계와 결합하여 식물 내 이차대사를 촉진한다. 유도물질 처리(elicitation) 기술은 식물 유래의 유용 화학 물질의 in vitro 생산성을 증대시킴으로써 식물세포 배양을 산업적으로 활용할 수 있는 가능성을 높인다. Sanguinarine 등의 BPAs를 주로 생산하는 또 다른 양귀비과 식물인 Eschscholtzia californica을 이스트 추출물 (yeast extract)로 처리한 선행연구 결과, elicitation은 BPA 생합성의 모든 유전자를 동시에 과발현 시킴으로써 이차 대사 산물의 생산성을 극대화시키는 것으로 나타났다. 이에 동일한 기술을 P. somniferum에 적용하여 현탁배양되는 식물 세포 내의 BIAs 생합성 관련 모든 유전자가 과발현되고 따라서 몰핀계 알칼로이드가 생산될 것을 기대하였다. 그러나, 실험결과, P. somniferum에서 BIAs 합성 경로에 공통적인 유전자와 BPAs 합성경로 상의 유전자들은 모두 과발현이 유도된 것과 달리 몰핀계 알칼로이드 생합성 경로에 특이한 유전자들은 각기 다른 발현 양상을 나타내었다. Salutaridinol 7-O-acetyltransferase (SAT)과 codeinone reductase (COR)은 elicitation에 의해 발현이 증가하였으나, salutaridine synthase (SS)의 축적은 유도되지 않았으며, 특히 salutaridine reductase (SS)는 elicitor 처리여부와 무관하게 미분화 세포에서는 발현하지 않았다. 이로부터, SR이 미분화세포의 몰핀계 알칼로이드 생합성 경로 대사공학에서 표적 유전자가 될 수 있음을 유추할 수 있었다. 이를 확증하기 위해, metabolomics, trasncriptomics, 및 proteomics 데이터를 아우르는 ‘integrated -omics study’를 실시하였는데, (1) 몰핀을 생산하지 않는 배양 세포와 morphine이 검출되는 식물 조직(잎, 뿌리, 줄기, 삭, 및 소식물체), (2) 미분화 세포와 이로부터 체세포배발생(somatic embryogenesis)에 의해 유도된 체세포배 간의 대사산물, 유전자, 단백질의 발현을 비교하였다. 그 결과, 몰핀계 알칼로이드 축적에 관여하는 laticifer 조직에서 발현되는 major latex protein (MLP)의 발현과 더불어 체세포배(somatic embryos)에서 SR의 발현이 분화 여부에 따라 차별 유도(differential induction)되는 것을 확인하였고, 이를 현탁배양 세포에서의 몰핀 생산을 위한 대사공학의 우선적인 표적 유전자로 선정하였다. 또한, 현재 양귀비과 식물에서 유전 정보가 알려져 있지 않은 thebaine과 codeine의 demethylation에 관여하는 O-demethylase (ODM) 반응에 대한 대사공학 여부를 알아보기 위하여 유사한 기질 특이성을 갖는 vanillate O-demethylase를 Pseudomonas sp.로부터 분리하여 thebaine 및 codeine을 기질로 사용하는 것을 확인하였으며, 이를 바탕으로 P. somniferum의 thebaine/codeine O-demethylase의 partial sequence를 동정하였다. 미분화 세포의 경우, thebaine 및 codeine에 대한 demethylation 효소 활성을 가지고 있으므로, 본 연구에서는 앞서 선정된 SR에 대한 대사공학을 실시하여, 몰핀계 알칼로이드 생합성 경로를 조절하고자 하였다. Agrobacterium tumafaciens를 매개로 하여, SR을 P. somniferum 미분화 세포에서 과발현시키는 형질전환을 실시하였다. SR이 과발현된 식물세포에서는 SR 활성이 증가하였으며, 특히 몰핀계 알칼로이드의 생산성이 약 153.6 µ
g/g DW으로 체세포배에 비하여 약 4.5배 증가한 것으로 나타났다. 또한 체세포배에서 morphine만이 생합성되던 것에 비해, SR-과발현 형질전환 세포에서는 morphine 35.3 µ
g/g DW, thebaine 108.6 µ
g/g DW 및 codeine 15.3 µ
g/g DW이 모두 검출되어, SR-과발현에 의하여 몰핀계 알칼로이드 생합성 경로가 전체적으로 영향을 받음을 알 수 있었다. 본 연구를 통해, 양귀비과 식물인 Papaver somniferum에서 대사물질의 생산성이 다른 식물 조직을 대상으로 대사물질에 관여하는 유전자와 단백질의 발현 양상을 비교하여 적절한 대사공학 표적 유전자를 선정하고, 대사공학을 통해 미분화 세포의 몰핀계 알칼로이드 생산 경로를 조절할 수 있음을 밝혔다.
Suspension cultures of Papaver somniferum have been studied as bioreactor systems for in vitro production of benzylisoquinoline alkaloids (BIAs) the plants produced. To stimulate BIA biosynthetic pathway in the suspension cultures, YE was applied as an elicitor. YE affected accumulation of benzophenanthridine alkaloids (chelirubine, sanguinarine, etc.) (BPAs) accompanying with accumulation of gene transcripts and proteins involved in BPAs biosynthesis
however, although salutaridinol 7-O-acetyltransferase (SAT) and codeinone reductase (COR) were induced by elicitation, morphinan alkaloids such as thebaine, codeine and morphine were not detected in elicitor-treated suspension cultures. Elicitation using yeast extract may not enhance the morphine biosynthesis and targeted metabolic engineering might be needed to regulate secondary metabolism related to morphinan alkaloid biosynthesis in suspension cultures of P. somniferum. To determine the proper target gene for metabolic engineering, integrated -omics study was performed through comparative profiling of metabolite, gene transcripts and proteins between morphine-free undifferentiated cells and morphine-containing plant tissues of P. somniferum. Of BIAs biosynthetic enzymes, salutaridine reductase (SR) was differentially expressed in morphine-producing plant tissues, which implied that SR would be under developmental regulation and could be a possible target for metabolic engineering for in vitro morphine production in suspension cultures. For investigating developmental regulation of gene transcript and protein expression, somatic embryogenesis was induced from undifferentiated callus and the BIAs biosynthesis in both somatic embryos and callus was monitored in terms of metabolites, gene transcripts and proteins. Results showed that all genes and proteins related to morphine-specific biosynthesis were up-regulated by somatic embryogenesis. Differential induction of SR following somatic embryos might be resulted from the development of laticifer tissues in undifferentiated callus, which was confirmed by differential expression of major latex protein (MLP), the most abundant protein in opium poppy laticifer where morphine accumulates in intact plants. O-demethylation of thebain and codeine is essential to synthesize morphine, but the molecular information on O-demethylase of P. somniferum has never been reported up to now. Pseudomonas sp. vanillate O-demethylase showing the substrate specificity to chemicals of similar structure to morphine, was selected as a template enzyme to characterize demethylating activity in opium poppy. Based on the result from experiments on O-demethylating activity of P. somniferum, undifferentiated cells also had O-demethylase activity, thus this step was not attempt to modulate via metabolic engineering. SR-activated opium poppy transgenic callus were generated via Agrobacterium-mediated transformation. The transformants showed up-regulation of SR produced thebaine, codeine and morphine 4.5 times higher than somatic embryos, which might be attributed to expression of SR even in undifferentiated cells. In this study, we suggest (1) integrated -omics through comparative profiling of metabolite, gene transcript and protein expression can provide information on selecting proper target gene for metabolic engineering
(2) inability of undifferentiated opium poppy cells to biosynthesize morphinan alkaloids may be resulted from developmental regulation of the related pathway
and (3) in vitro morphinan alkaloid production can be achieved by targeted metabolic engineering to activate genes which are developmentally regulated. We expect that our results and the methods for analysis of morphine-specific biosynthetic pathway will contribute the in vitro production of morphinan alkaloids in plant cell culture and understanding of the secondary metabolism at the molecular level.
URI
http://postech.dcollection.net/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000781979
http://oasis.postech.ac.kr/handle/2014.oak/791
Article Type
Thesis
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