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단일 소낭 측정법을 이용한 신경 세포 소낭 융합 연구

Title
단일 소낭 측정법을 이용한 신경 세포 소낭 융합 연구
Authors
김재열
Date Issued
2014
Publisher
포항공과대학교
Abstract
Synaptic vesicle fusion is a key process for the communication between neuron cells. For fast and precise communication at synapses, the synaptic vesicles fusion should be highly regulated. To do this, SNARE proteins and their regulatory proteins interact actively and cooperatively during fusion processes. Controllable vesicle system and measurements are required to understand this complex fusion processes. An emerging technique, so called single-molecule fluorescence, in biophysics facilitates measurement of the dynamic and static heterogeneity of biomolecules. In this thesis, single-vesicle measurement in solution was achieved for studying SNARE-mediated vesicle fusion, neurotoxicity of α-synculein oligomers and fast millisecond dynamics of vesicle tethered single-molecule. Firstly, a single-molecule technique, so called Alternating-laser excitation (ALEX), was applied for studying synaptic vesicle docking and fusion. We demonstrated that ALEX technique can simultaneously measure the docking and fusion of individual vesicles in a solution. Using ALEX, we found that synaptoatagmin-1(Syt1) that exists in the synaptic vesicle can act as a docking factor. This Syt1-mediated vesicle docking necessarily requires PIP2 and t-SNARE interactions, which results in tremendous increment in the rate of vesicle docking compared with the SNARE-mediated docking. This enhancement in docking rate by Syt1 also increases the overall fusion rate. This find that Syt1 helps vesicle docking but does not inhibit SNARE assembly for fusion. Following the Syt1-mediated vesicle docking, the replacement of Syt1 by v-SNARE, synaptobrevin/VAMP-2, and rebinding of Syt1 by the addition of Ca2+ were sequentially observed. On the basis of these sequential actions of Syt1 on SNAREs, we suggested a novel model for synaptic vesicle fusion. Secondly, the neurotoxicity of α-synculein oligomers on synaptic vesicle fusion has been investigated by single-vesicle assay. α-synculein is known as the pathogenic molecule for Parkinson’s disease. For the first time, the inhibition effect of α-synculein oligomers on the vesicle fusion has been reported in this work. Specifically, α-synculein oligomer inhibits SNARE-mediated vesicle docking, which is caused by its ability to interact with v-SNARE. Lastly, a single-vesicle technique for measuring fast single-molecule dynamics on a millisecond time scale has been investigated. Diffusion-based single-molecule FRET has been limited by the short duration of observation time. By tethering, single-molecule of interest to vesicles, a huge increase in observation time was achieved. Using this new technique, the dynamics of Holliday junction in millisecond temporal resolution were investigated.
신경세포 소낭 융합은 두 개의 서로 다른 뉴런 세포간의 커뮤니케이션에 있어서 핵심적인 프로세스이다. 매우 빠르고 정확한 커뮤니케이션을 위해서 소낭 융합 반응은 매우 정교하게 조절되어야 한다. 이를 위해 융합 반응에서 스네어(SNARE) 단백질과 스네어 조절 단백질들은 역동적이고 협력적으로 상호작용한다고 알려져 있다. 이러한 복잡한 융합 과정을 이해하기 위해서는 제어 가능한 소낭 시스템과 측정법들을 필요로 한다. 한편, 최근 생물물리 분야에 새롭게 등장한 단일 분자 형광 기술은 생분자의 동역학과 이질성(Heterogeneity)을 측정하므로 새로운 소낭 융합 연구를 가능하게 하였다. 이 논문에서는 단일 소낭 측정법을 적용하여 스네어에 의한 소낭 융합 현상을 연구하였다. 또한 알파시뉴클린의 독성 기작을 이해하고자 하였으며, 추가적으로 소낭 접착(tethering)을 이용하여 매우 빠른 단일분자의 동역학 측정을 가능하게 하였다. 첫째로, 단일 분자 기술 중 하나인 교차여기분광법(ALEX)을 소낭의 안착과 융합을 연구하는데 적용하였다. 먼저, 우리는 교차여기분광법이 개개의 소낭의 안착과 융합을 동시에 관측할 수 있음을 보였다. 이를 이용하여 소낭에 존재하는 시넵토태크민(Synaptotagmin-1)이 안착의 주 요소임을 알아냈다. 이러한 시넵토테그민에 의한 안착은 PIP2 와 t-SNARE와의 상호작용을 필요로 함을 알 수 있었다. 시넵토테그민에 의한 안착은 스네어에 의한 안착에 비해 매우 빠르게 일어나게 되며 이러한 안착의 증가는 전체 소낭 융합과정 속도의 증가를 나타내게 만들었다. 이뿐만 아니라 시넵토테그민에 의해 안착된 이후에 v-스네어가 t-스네어와 결합하게 되면서 시넵토테그민은 잠시 떨어지게 되지만 Ca2+ 에 의해 다시 결합됨을 측정할 수 있었다. 이러한 측정 결과들을 바탕으로 시넵토테그민의 순차적 역할에 관한 새로운 모델을 제시하였다. 둘째로, 단일 소낭 측정법을 이용하여 파킨슨병의 발병인자로 알려져 있는 알파시뉴클린의 독성기작에 대해 연구하였다. 우리는 알파시뉴클린 올리고머에 의한 신경소낭 융합 저해 현상을 최초로 발견하였다. 특별히, 알파시뉴클린 올리고머는 v-SNARE와의 결합을 통해 스네어에 의한 소낭의 안착을 방해한다는 작용기작을 밝혀냈다. 끝으로, 단일 분자의 밀리초 단위의 빠른 동역학을 측정할 수 있는 방법을 연구하였다. 확산기반 단일 분자 형광에너지 전달법(FRET)은 단일 분자를 측정할 수 있는 시간이 매우 짧다는 한계를 보여왔다. 우리는 단일 분자를 소낭에 부착함으로써 측정시간의 큰 증가를 얻을 수 있었다. 이를 이용하여 할리데이정션(Holliday Junction)의 동역학을 밀리초의 분해능으로 측정할 수 있었다.
URI
http://postech.dcollection.net/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000001673778
http://oasis.postech.ac.kr/handle/2014.oak/2071
Article Type
Thesis
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